血管内皮细胞培养

1、 入率，损伤越重，DNA合成减少，3H-TdR掺入率就愈低。细胞培养液中乳酸脱氢酶（lactatedehydrogenase,匕口测定因细胞被损伤可使内含物渗出到培养液中，随着损伤的加重，渗出物增多，其测定方法与以前介绍练习的用LDH释放法检测NK细胞活性的操作相类似。.促进EC合成或释放一氧化氮（nitricoxide,NO）药物的实验原理EC能释放多种活性因子，其中NO为血管舒张因子，能阻止AS病变的形成，故试验观测NO释放的多少，就可确定药物抗AS及其机理的方式之一。实验设计与样品的收集取第2代生长良好的EC,常规制备单细胞悬液，调细胞浓度为2X105/ml,接种于24孔板，0.5ml/

2、孔，待呈融合状态时，去上清，用无血清无酚红的M199液淋洗23次，即可进行实验。观察药物对EC分泌NO的量效关系正常组（加入无血清无酚红的M199）；含药物的M199溶液组（一般分为5个药物浓度）；含药物的M199及EDTA溶液组（选定一个有效药物浓度，EDTA的终浓度为0.02%）,每孔总体积0.5ml（原量），设复孔6个，置孵温箱中培养24h,收集上清样品，待测NO的含量（或以OD值表示）。观测药物对EC分泌NO的时效关系同样设上述三组，后二组选定一个有效的药物浓度，在孵育箱中培养0.5、1、2、4、6h后，分别收集上清液样品，在酶标仪上550nm处检测OD值。NO浓度的测定取3份体积的上

3、清液+1份体积的Gress试剂（10%对氨基苯磺酸，0.1%N-奈基乙二胺，2.5ml%磷酸）混合后，在550nm波长处检测OD值，或用NO检测试剂盒检测，从已知标性的曲线上换算得出其含量的浓度，以umol/L表示。用t检验比较组间差异性。形态学观察比较各实验组的变化。结果分析具有促进NO合成和释放的药物，在适当的浓度下可使量效实验的给药组上清液中NO浓度升高，并呈量效关系；药物+EDTA组上清液中NO浓度可能不变，这是因为有EDTA螯合了钙离子，影响了EC中NO合成酶的激活所致。在时效关系实验中,单给药组可呈时效关系曲线,其它二组基本不变。在形态方面，试验24h后有促进NO合成和释放的药物，

4、（单给药组）EC仍呈融合状态，变化不明显。余EC呈边缘皱缩，细胞间隙增大，细胞质中有大小不等的颗粒状空泡。.用6-酮前列腺素F1放射免疫检测盒间接检测药物促EC分泌前列腺环素(PGI2)的水平。我们已知PGI2是最强的血管扩张剂和血小板聚集抑制剂，EC是PGI2的主要合成场所。PGI2很不稳定，尤其在体内，半衰期只有23min无法直接测定，只能通过其稳定的代谢物6-酮-PGF-1的测定来间接反映PGI2的含量。原理抗6-酮-PGF-1抗体与血浆或EC上清液中的6-酮-PGF-1抗原结合形成特异性抗原抗体复合物，向该反应体系中加入一定量的3H标记的6-酮-PGF1作为示踪剂，当抗体量不足时，示踪

5、剂与样品中的6-酮-PGF-1竞争抗体。加入第二抗体或活性炭将抗原抗体复合物和游离的抗原分开，测定抗原抗体复合物放射性，即可算出样品中6-酮-PGF-1的含量，具体操作按试剂说明书进行。注意事项EC培养上清液中的6-酮-PGF-1含量比血浆高许多培，检测时可适当稀释。4氧化型低密度脂蛋白介导单核细胞粘附的实验原理当前认为单核细胞(monocyte,MC)粘附于血管内皮细胞(vasculerendothelialcell,VEC)是循环MC进入动脉内膜，并且局部形成泡沫细胞的前提，故实验观测oxLDL(oxidelowdensitylipoprotein,oxLDL)对MC与VEC间的粘附。且已

6、有试验证明经oxLDL处理的VEC可提高对MC的粘附力45倍，36h达高峰，经oxLDL处理的MC也可提高对VEC的粘附性，1h即达高峰并继续24h。因此观察oxLDL对MC与VEC间的粘附是研究抗动脉粥样硬化药的作用机理之一。放射性同位素标记MC法测定oxLDL介导VEC的粘附作用用51Cr标记的MC细胞与培养的VEC孵育，然后洗掉未粘附的乂0加入NaOH溶解与EC粘附的MC。通过测定放射性即可算出与VEC粘附的MC百分率。白细胞的分离抗凝全血(EDTNa212mg/ml血)+等量6%的右旋糖酐生理盐水液，于37静置30min,使RBC沉淀，吸出上层液体于3ml淋巴细胞分离液上，2000r/

7、minX20离心，在二层液面交界处为乂离心管底部为多形核白细胞(polymorphonuclearneutrophilcell,PMNC),分别吸出两种WBC,力口D-Hanks液1000r/minX10去上清，加Tris-NH4cl缓冲液(0.16mol/LNH4Cl和0.17mol/LTris,91混合pH7.2)1ml作用35min溶解RBC,补足D-Hanks液到原体积，1000r/minX10,去上清，再悬浮于D-Hanks液中。WBC的标记将上述WBC用D-Hanks液调整到5X106/ml,加入5iCr20i/ml（终浓度），37孵育1h,用D-Hanks洗涤三次，用M199完全

8、培养液再悬浮，备用。实验设计正常组：VEC+5iCr标记的MC；模型组：VEC+oxLDL+5iCr标记的MC；实验组：VEC+药物（有效剂量）+oxLDL+51Cr标记的MC实验步骤将预先制备好的含2X105/mlEC的M199完全培养液加入24孔板，每孔0.5ml培养成单层融合时，加入含一定浓度药物的M199液0.5ml继续孵育箱培养12h,完全洗去药物，加入含oxLDL的M199完全培养液0.5ml继续培养（终浓度50mgTG/L）12h,完全洗oxLDL（一般用D-Hanks液洗三次）加入51Cr标记的MC5X106/ml0.5ml,孵育箱培养5min,去上清，每次用0.5mlD-Ha

9、nks液淋洗3次以去除未吸附的乂0加入1mol/L的NaOH0.5ml溶解MC,用-记数仪检测液体中的放射性，可求出VEC粘附MC的百分率。白细胞髓过氧化酶法原理单核细胞及中性粒细胞内含有丰富的髓过氧化酶,将粘附在内皮细胞上的白细胞用HTAB（十二烷基三甲基溴化铵）溶解后，髓过氧化酶即可释放出来，然后加入H2O2及底物，经显色反应后，用酶标仪测OD值，即可求出粘附的白细胞量。标体制备白细胞的分离及内皮细胞培养同前。测定步骤将内皮细胞传入96孔板培养成单层融合细胞,根据实验目的进行预处理。然后加入100l白细胞（5X106个细胞/ml）,于375%CO2中孵育30min,用PBS洗三次以去除未粘附白细胞，加入50l溶于PBS（pH6.0）中的0.5%HTAB,使白细胞溶解，再加入200l0.63mmol/L的二盐酸邻联茴香胺（含0.