马铃薯抗逆相关基因SnRK2家族的克隆与功能分析

1、马铃薯抗逆相关基因SnRK2家族的克隆与功能分析蔗糖非酵解型蛋白激酶2( Sucrose non-fermenting1-related proteinkinase2 , SnRK2是植物细胞内一类蔗糖非酵解型-1 (SNF)蛋白激酶，其与植 物对逆境信号的响应有关。 本研究利用生物信息学方法结合同源序列克隆， 从马 铃薯基因组中筛选并克隆了马铃薯 StSnRK2基因家族序列；利用生物信息学方法 分析了基因的特性及功能；通过构建GFP融合载体对其进行了亚细胞定位；运用 实时定量荧光(qRT-PCR技术研究了 StSnRK2的组织表达特性和不同逆境胁迫 下StSnRK2基因家族的表达特性与生理特

2、性；通过转化烟草，检测了转基因植株 中抗逆相关基因的表达特性，初步揭示了马铃薯StSnRK2基因家族成员的功能、表达模式及可能参与的抗逆信号途径。主要研究结果如下： 1、 通过生物信息学分析结合同源克隆， 从陇薯 3 号中 得至IJ了 8个马铃薯SnRK洲因家族的成员，分别命名为StSnRK2.12.8(GenBank 登录号：JX280911JX280918)。该基因家族核甘酸片段大小在10081089bp,氨基酸序列在335362aa,等电点为4.886.08 ,分子量大小为37.44 41.49KDa。生物信息学分析表明该基因家族成员都含有Ser/Thr 蛋白激酶的核心功能域； 同源序列

3、比对分析和聚类结果显示该基因家族和已报道的拟南芥、 水稻、 玉米的SnRK2s因家族具有高度的同源性；根据其氨基酸序列与功能的相似性将家族成员分为 3组， 第一组成员包括StSnRK2.1、StSnRK2.2、 StSnRK2.5、 StSnRK2.7和 StSnRK2.8,第二组成员有 StSnRK2.4和 StSnRK2.6,第三组成员有 StSnRK2.3。 基因结构分析显示，该基因家族成员中仅StSnRK2.6含有7个外显子，其他成员均含有 9 个外显子； 对其 2kb 的前导序列进行分析发现该基因家族8 个成员含有 植物抗逆相关元件ABRE DREW LTRE但不同成员所含元件个数之

4、间存在差异。2、采用激光扫描共聚焦显微镜法，对马铃薯StSnRK2基因与GFPa合蛋白进行了亚细胞定位，结果显示马铃薯SnRK2s因家族成员主要定位在细胞质和细 胞核中。3、利用RT-PCR佥测了 StSnRK2基因家族成员的组织表达特性，发现在马铃薯不同组织中基因的相对表达量存在明显差异。StSnRK2a因在马铃薯根、茎、叶和薯块中均有表达；StSnRK2.1、StSnRK22 StSnRK2.5和StSnRK2.6四个基因在根中表达量最高， StSnRK2.7基因在茎中表 达量最高，StSnRK2.3和StSnRK2.8两个基因在叶中表达量最高， StSnRK2.4基 因在薯块中表达量最高

5、。4、马铃薯试管苗在NaCl和PEG办迫下，StSnRK2基因 家族 8 个成员的相对表达量都呈现出先升高后下降的趋势。在 NaCl 胁迫 24h 后，StSnRK2.1、 StSnRK22 StSnRK2.4和 StSnRK2.6 四个基因的相对表达量显著升高，之后虽然呈现出下降趋势，但在胁迫处理48h后相对表达量仍然高于对照水平，但是 StSnRK2.3、StSnRK25 StSnRK2.7和 StSnRK2.8四个基因在胁迫处理48h后相对表达量低于对照水平。在PEG办迫下， StSnRK2.1、StSnRK22 StSnRK2.3 和 StSnRK2.4 四个基因在胁迫处理 48h 后

6、相 对表达量仍然高于对照水平，StSnRK2.5和StSnRK2.6两个基因的相对表达量降低至对照水平，而StSnRK2.7和StSnRK2.8两个基因的相对表达量降低幅度较 大，在胁迫处理48h 后显著低于对照水平。外源ABA只能诱导StSnRK2.3基因相对表达量的明显升高。5、盆栽马铃薯 植株在水分胁迫下，StSnRK2基因家族8个成员的相对表达量在大西洋和陇薯 3 号两个品种之间存在显著差异。StSnRK2.1、StSnRK2.2和StSnRK2.3三个基因在两个品种中均表现为水分胁迫后相对表达量显著升高的趋势； StSnRK2.7 的相对表达量与对照无显著差异，而StSnRK2.4在

7、陇薯3号中的相对表达量是对照的9.5倍，是水分胁迫后8个基因成员相对表达量最高的一个基因；StSnRK2.1、 StSnRK2.2、 StSnRK2.3、StSnRK2.4和StSnRK2.6五个基因的相对表达量均与电导率、 脯氨酸、CAT PODSOD?生理指标呈极显著正相关，StSnRK2.5和StSnRK2.8两个基因的相对表达量与生理指标呈极显著负相关，StSnRK2.7基因的相对表达量与生理指标无显著相关性。6、构建了 CaMV353动子驱动的StSnRK2基因植物表达载体pBI121-35S-StSnRK2,用根癌农杆菌介导法转化烟草。在转StSnRK2基因家族的烟草中，除转化StSnRK2.7植株外，其他基因的转化植株中CBL3 NtERD10A NtERD10B NtERD10cH个抗旱相关基因的表达明显增加。对转基因植株进行20%PEG、迫后生理相关指标发生了变化，StSnR