神经生物学实验课细胞培养1课件

1、细胞培养体外培养（In vitro）* 细胞培养 (cell culture)： 是把取得的组织用机械或消化的方法分散成单个细胞悬液，然后进行培养生长。* 组织培养 (Tissue culture)： 把活体的一小片组织置于底物上孵育，细胞自其周围移出并生长。 *器官培养 (Organ culture)： 系将活体中器官或一部分器官取出，置于体外生存、生长并同时保持其一定的结构和功能特征。一、基本概念原代培养 源自体内新鲜组织的细胞在体外条件下生长，在传代之前称为原代培养。传代培养 细胞在培养器皿中生长一定时间后，被分开接种到新的培养器皿中。 基本概念二、细胞培养技术的主要优点1. 研究的对象

2、是活的细胞。2. 研究的条件可以人为的控制。3. 研究的样本，可以达到比较均一性。4. 研究的内容便于观察、检测和记录。5. 研究的范围比较广泛。6. 研究的费用相对较经济。 在实验过程中，根据要求可始终保持细胞的活力，并可长时期的监控、检测甚至量评估一部分活细胞的情况，包括其形态、结构和生命活动等。这点是其他方法所无法取代的。通过细胞培养所得到的细胞系属同一类型的细胞，可以达到均一性。利于单一细胞实验的定性和定量统计。通过倒置相差显微镜外接照相,摄影等直接观察活的细胞；电子显微镜分析细胞的超微结构；同位素标记、放射免疫等方法检测细胞内物质的合成、代谢的变化等、通过激光共聚焦，荧光显微镜等来观

3、察细胞内的物质的变化及检测细胞的凋亡等。BGC-823细胞多种学科均可利用细胞培养进行研究，如：细胞学、免疫学、肿瘤学、生化学、遗传学、分子生物学等。可供实验的组织来源众多，包括各种动物的各类组织，可以是动物的胚胎或成体，可以是正常组织或肿瘤组织等。细胞培养可以大量提供在同一时期、条件相同、性状相似的实验样本，因此有时可比体内实验经济的多。例如，一个需要100只鼠才能得出结论的实验可能用100片盖玻片或几个多孔培养板而获得具有相同统计学意义的结果。1、实验所需仪器设备（无菌室）：超净工作台，压力蒸汽消毒器，电热干燥箱， 滤器，酸缸CO2培养箱倒置显微镜液氮罐自动双重纯水蒸馏器或纯水仪超净台 超

4、净工作台的工作原理是利用鼓风机驱动空气遁过高效滤器除去空气中的尘埃颗粒，使空气得到净化。净化空气徐徐通过工作台面，使工作台内构成无菌环境。 CO2培养箱 CO2培养箱设定的条件为37 , 5 CO2 。 使用CO2培养箱培养细胞时应注意的 问题： 用螺旋口瓶培养细胞时，需将瓶 盖微松，以保证通气。 保持培养箱内空气干净。定期消毒 （90 ，14 h；紫外线；酒精擦拭)。箱内加灭菌蒸馏水3000毫升蒸馏水于 槽中以保持箱内湿度，避兔培养液蒸发。自动双重纯水蒸馏器 纯水仪2、实验所需培养器皿：培养瓶培养皿吸管冻存管，等3、实验所需手术器械：剪刀大镊子直头和弯头眼科镊子直头和弯头眼科剪等 （1）培养

5、基 （2）消化液 （3）清洗液4. 细胞培养用液合成培养基是根据细胞生存所需物质的种类和数量，用人工方法模拟合成的。目前已设计出许多种培养基，如TC199、MEM、RPMI-1640、 DMEM等。主要成分：氨基酸、维生素、碳水化合物、 无机盐和其它一些辅助物质。优点：标准化生产，组分和含量相对固定，成本低 缺点： 缺少某些成分，不能完全满足体外细胞生长需要。 人工合成培养基只能维持细胞生存，要想使细胞生长和繁殖，还需补充一定量的天然培养基（如血清）。 血清中含有： 多种蛋白质（白蛋白、球蛋白、铁蛋白等） 多种金属离子； 激素； 促贴附物质，如纤粘蛋白、冷析球蛋白、胶原等。 各种生长因子 转移

6、蛋白 不明成分血清质量好坏是实验成败的关键。常用血清有胎牛血洁、新生牛血清、小牛血情、兔血清、马血清等，其中以胎牛血清质量最好。优质血清的标准：透明，淡黄色，无沉淀物，无细菌、支原体、病毒污染。血清的灭活（消除补体活性）：56 ，30 分钟血清的消毒：过滤除菌在培养液配制后，培养液内常加适量抗菌素，以抑制可能存在的细菌的生长。通常是青霉素和链霉素联合使用。培养基内青霉素、链霉素最终使用浓度为每毫升100单位。庆大霉素：每毫升100单位方便、广谱、稳定抗菌素的使用完全培养基的组成基础培养基 80一95血清 5一20碳酸氢钠 2.0 g/L青、链霉素 各100卑位毫升培养基的配制 RPMI-164

7、0 培养粉 1袋 碳酸氢钠 2.0 g 青、链霉素 各100单位毫升 加三蒸水 至 1000ml, 过滤除菌。 调节pH值至7.2 加血清（终浓度 10） 胰蛋白酶：作用于与赖氨酸或精氨酸相连接的肽健，除去细胞间粘蛋白及糖蛋白，影响细胞骨架，从而使细胞分离。 胰蛋白酶液浓度越高，作用越强，但超过一定限度会损伤细胞。 胰蛋白酶是一种黄白色粉末，用无Ca2+、Mg2+的PBS缓冲液配制常用的胰蛋白酶液浓度是0.25 。用滤器过滤除菌。胰蛋白酶液消化时间：2-10分钟。用含血清培养液终止其对细胞的消化作用 消化液EDTA：乙二胺四乙酸。是一种化学螯合剂，能够与细胞表面的粘附分子结合，破坏细胞之间的连

8、接。一般使用浓度为0.02%。由于EDTA不能用含血清培养液终止其对细胞的消化作用，所以使用后应将培养瓶彻底清洗，否则再次培养时细胞容易脱壁。 用滤器过滤除菌。消化液清 洗 液水：新鲜配置的三蒸水或双蒸水平衡盐溶液 ( BSS ) ：含Ca2+、Mg2+的缓冲液 无Ca2+、Mg2+的缓冲液（作为胰蛋白酶配置的基础液）磷酸盐缓冲液（ PBS ）：NaCl 8.0 g KCl 0.2 g Na2HPO4.H2O 1.56 g KH2PO4 0.20 加水至1000 ml 5、细胞培养所用玻璃及塑料制品的清洗与消毒清 洗在组织细胞培养中，体外细胞对任何有害物质都非常敏感,均能影响培养细胞的生长微生

9、物上次细胞残留物非营养成分的化学物质需要清洗的培养用品玻璃器皿的清洗胶塞的清洗塑料制品的清洗玻璃器皿的清洗包括浸泡、刷洗、浸酸和冲洗四个步骤清洗后的玻璃器皿干净透明无油迹不能残留任何物质浸泡：初次使用和培养使用后的玻璃器皿均需先用清水浸泡，以使附着物软化或被溶掉新的初次使用的玻璃器皿，在生产及运输过程中，玻璃表面带有大量的干固的灰尘，且玻璃表面常呈碱性及带有一些对细胞有害的物质等先用自来水简单刷洗，然后用5稀盐酸液浸泡过夜，以中和其中的碱性物质再次使用的玻璃器皿则常附有大量刚使用过的蛋白质，干固后不易洗掉用后立即浸入水中，要求完全浸入，不能留有气泡或浮在液面上刷洗：用毛刷沾洗涤剂刷洗，以除去器

10、皿表面附着较牢的杂质刷洗要适度，过度会损害器皿表面光泽度浸酸：玻璃器皿浸泡到清洁液中清洁液对玻璃器皿无腐蚀作用，而其强氧化作用可除掉刷洗不掉的微量杂质浸泡时器皿要充满清洁液，勿留气泡或器皿露出清洁液面浸泡时间：一般为过夜，不应少于6 小时清洁液 常用三种：重铬酸钾（g）浓硫酸（ml）蒸馏水（ml） 强清洁液 631000200 次强清洗液 120 2001000 弱清洁液 100 1001000配制时应注意安全，须穿戴耐酸手套和围裙，并要保护好面部及身体裸露部分配制过程中可使重铬酸钾溶于水中，然后慢慢加浓硫酸。并不停的用玻璃棒搅拌，使产生的热量挥发，配制溶液应选择塑料制品。配成后清洁液一般为棕

11、红色冲洗在使用后，刷洗及浸泡后都必须用水充分冲洗。使之尽量不留污染或清洁液的残迹最好用洗涤装置如用手工操作需流水冲洗十次以上，每次水须灌满及倒干净，最好用蒸馏水清洗3-5 次，晾干备用胶塞的清洗新购置的瓶塞带有大量滑石粉及杂质，应先用自来水冲洗，再做常规处理常规清洗方法每次用后立即置入水中浸泡，用2% NaOH 或洗衣粉煮沸10-20 分钟（以除掉培养中的蛋白质），自来水冲洗，蒸馏水冲洗2-3次，晾干备用塑料制品的清洗塑料制品现多是采用无毒并已经特殊处理的包装，打开包装即可用，多为一次性物品必要时用2% NaOH 浸泡过夜，用自来水充分冲洗，再用5%盐酸溶液浸泡30 分钟，最后用自来水和蒸馏水冲洗干净，晾干备用。消 毒细胞培养的最大危险是发生培养物的细菌、真菌和病毒等微生物的污染常见原因：操作间或周围空间的不洁培养器皿和培养液消毒不合格或不彻底由于有关培养的每个环节的失误均能导致培养失败，故细胞培养的每个环节都应严格遵守操作常规，防止发生污染消毒灭菌方法物理消毒灭菌法紫外线：用于空气，操作台表面和不能使用其它法进行消毒的培养器皿，30min湿热（高压蒸气灭菌法）：121，20min(玻璃制品及塑料制品，如培养皿，培养瓶，离心管，手术器械等)干烤：160, 2 小时过滤：0.22m（液体）化学消毒灭菌法70%酒精