基因工程操作步骤

1、关于基因工程的操作步骤第1页，共46页，2022年，5月20日，8点15分，星期四基因工程的基本操作程序1.目的基因的获取2.基因表达载体的构建3.将目的基因导入受体细胞4.目的基因的检测与鉴定第2页，共46页，2022年，5月20日，8点15分，星期四第3页，共46页，2022年，5月20日，8点15分，星期四知识点一：1.原核细胞的基因结构非编码区非编码区编码区编码区上游 编码区下游 与RNA聚合酶结合位点启动子终止子启动子：位于基因首端一段能与RNA聚合酶结合并能起始mRNA合成的序列。没有启动子，基因就不能转录。终止子：位于基因的尾端的一段特殊的DNA片断，它能阻碍RNA聚合酶的移动，

2、并使其从DNA模板链上脱离下来，使转录终止。RNA聚合酶:能够识别启动子上的结合位点并与其结合的一种蛋白质.(以模板转录然后脱落)第4页，共46页，2022年，5月20日，8点15分，星期四不能转录为信使RNA，不能编码蛋白质。能转录相应的信使RNA，能编码蛋白质 编码区非编码区原核细胞的基因结构有调控遗传信息表达的核苷酸序列，在该序列中，最重要的是位于编码区上游的RNA聚合酶结合位点。非编码区非编码区编码区编码区上游 编码区下游 启动子终止子第5页，共46页，2022年，5月20日，8点15分，星期四第6页，共46页，2022年，5月20日，8点15分，星期四能够编码蛋白质的序列叫做外显子

3、不能够编码蛋白质的序列叫做内含子编码区非编码区非编码区与RNA聚合酶结合位点内含子 外显子 启动子终止子编码区上游 编码区下游 内含子： 外显子： 知识点一：2.真核细胞的基因结构第7页，共46页，2022年，5月20日，8点15分，星期四真核细胞的 基因结构编码区非编码区外显子：能编码蛋白质的序列内含子：不能编码蛋白质的序列有调控作用的核苷酸序列，包括位于编码区上游的RNA聚合酶结合位点等。非编码序列：包括非编码区和内含子编码区非编码区非编码区与RNA聚合酶结合位点内含子 外显子 启动子终止子编码区上游 编码区下游 第8页，共46页，2022年，5月20日，8点15分，星期四原核细胞真核细胞

4、不同点编码区是_的编码区是间隔的、_的相同点都由能够编码蛋白质的_和具有调控作用的_区组成的原核细胞与真核细胞的基因结构比较思考编码相同数目氨基酸的蛋白质，原核细胞与真核细胞基因结构一样长吗？连续不连续编码区非编码第9页，共46页，2022年，5月20日，8点15分，星期四1、目的基因的获取2、基因表达载体的构建3、将目的基因导入受体细胞4、目的基因的检测与鉴定知识点二.基因工程基本操作的四个步骤第10页，共46页，2022年，5月20日，8点15分，星期四第11页，共46页，2022年，5月20日，8点15分，星期四一、获取目的基因1.获取目的基因的途径 A.从自然界已有的物种中分离 B.人

5、工合成2.获取目的基因的方法 A.从基因文库中获取 B.利用PCR技术扩增 C.利用化学方法人工合成目的基因主要是_编码蛋白质的结构基因第12页，共46页，2022年，5月20日，8点15分，星期四一、目的基因的获取（一）从基因文库中直接获取1.基因文库：概念见P92.基因文库的分类:按外源DNA片段的来源分类种类基因组DNA文库：含有一种生物的全部基因部分基因文库：只包含了一种生物的部分基因， 如：cDNA文库3.基因文库的目的为了在不知目的基因序列的情况下，便于获得所需的目的基因。4.获取目的基因的根据：见课本P9第13页，共46页，2022年，5月20日，8点15分，星期四提取某种生物的

6、全部DNA用适当的限制酶切一定大小的DNA片段将DNA片段与载体连接导入受体菌中储存基因组文库5.基因文库的构建方法之一（1）直接分离法(鸟枪法)第14页，共46页，2022年，5月20日，8点15分，星期四cDNA合成过程 第一步，反转录酶以RNA为模板合成一条与RNA互补的DNA单链，形成RNA-DNA杂交分子。第二步，核酸酶H使RNA-DNA杂交分子中的RNA链降解，使之变成单链的DNA。第三步，以单链DNA为模板，在DNA聚合酶的作用下合成另一条互补的DNA链，形成双链DNA分子。 5.基因文库的构建方法之第15页，共46页，2022年，5月20日，8点15分，星期四基因组文库和部分基

7、因组文库(cDNA文库)比较第16页，共46页，2022年，5月20日，8点15分，星期四 概念：PCR全称为_，是一项在生物_复制_的核酸合成技术 聚合酶链式反应体外特定DNA片段原理：DNA复制2、利用PCR技术扩增目的基因第17页，共46页，2022年，5月20日，8点15分，星期四四种脱氧核苷酸(dNTP) 一对引物：热稳定DNA聚合酶(Taq酶）模板DNA( 需含有目的基因 ) Mg2+(激活剂)条件：缓冲溶液一对寡核苷酸序列：与目的基因的起始段互补一段已知目的基因的核苷酸序列，以便根据这一序列合成引物前提：第18页，共46页，2022年，5月20日，8点15分，星期四利用PCR技术

8、扩增目的基因原理:DNA双链复制前提:要有一段已知目的基因的脱氧核苷酸序列，以便合成引物。第19页，共46页，2022年，5月20日，8点15分，星期四 过程高温变性（解旋为单链）低温退火（引物与单链互补结合）适温延伸（在Taq酶的作用下合成 与模板互补的DNA双链）重复循环预变性（增加DNA变性的概率）第20页，共46页，2022年，5月20日，8点15分，星期四2、具体过程第21页，共46页，2022年，5月20日，8点15分，星期四PCR(多聚酶链式反应)第22页，共46页，2022年，5月20日，8点15分，星期四 概念：PCR全称为_，是一项在生物_复制_的核酸合成技术 条件：_、

9、_、_ 、 _.等原理：_方式：以_方式扩增，即_（n为扩增循 环的次数）结果：聚合酶链式反应体外特定DNA片段DNA复制四种脱氧核苷酸一对引物DNA聚合酶指数2n使目的基因的片段在短时间内成百万倍地扩增要有一段已知目的基因的核苷酸序列（前提条件）第23页，共46页，2022年，5月20日，8点15分，星期四过程：a、DNA变性（90-95）：双链DNA模板 在热作用下，_断裂，形成_b、退火（复性55-65）：系统温度降低，引 物与DNA模板结合，形成局部_。 c、延伸（70-75）：在Taq酶的作用下，合成与模板互补的_。 氢键单链DNA双链DNA链第24页，共46页，2022年，5月20

10、日，8点15分，星期四PCR技术扩增与DNA复制的比较PCR技术DNA复制相同点原理原料条件不同点解旋方式场所酶结果碱基互补配对四种脱氧核苷酸模板、能量、酶DNA在高温下变性解旋解旋酶催化体外复制细胞核内热稳定的DNA聚合酶细胞内的DNA聚合酶大量的DNA片段形成整个DNA分子第25页，共46页，2022年，5月20日，8点15分，星期四目的基因的mRNA单链DNA (cDNA）双链DNA(即目的基因)反转录合成1）反转录法： 以目的基因转录成的信使RNA为模板，反转录成互补的单链DNA，然后在酶的作用下合成双链DNA，从而获得所需的基因。蛋白质的氨基酸序列mRNA的核苷酸序列结构基因的核苷酸

11、序列目的基因推测推测化学合成2）根据已知的氨基酸序列合成DNA法 ：3、人工合成的目的基因第26页，共46页，2022年，5月20日，8点15分，星期四二、基因表达载体的构建 基因工程的核心1、目的：所需物质：使目的基因在受体细胞中稳定存在，并且可以遗传给下一代，同时使目的基因能够表达和发挥作用。第27页，共46页，2022年，5月20日，8点15分，星期四2、基因表达载体的组成：复制原点+目的基因+启动子+终止子+标记基因第28页，共46页，2022年，5月20日，8点15分，星期四启动子：位于基因的首端的一段特殊的DNA片断，它是RNA聚合酶识别和结合的部位，有了它才能驱动基因转录出mRN

12、A，最终获得蛋白质终止子：位于基因的尾端的一段特殊的DNA片断，能终止mRNA的转录标记基因的作用是为了鉴别受体细胞中是否含有目的基因，从而将有目的基因的细胞筛选出来第29页，共46页，2022年，5月20日，8点15分，星期四载体与表达载体的区别：二者都有标记基因和复制原点两部分DNA片段。表达载体在载体基础上增加了目的基因、启动子、终止子三部分结构用到的工具酶：既用到限制酶切割载体，又用到DNA连接酶将目的基因和载体拼接，两种酶作用的化学键都是磷酸二酯键启动子、终止子对于目的基因表达必不可少目的基因不能单独进入受体细胞，必需以表达载体的方式携带进去。注意第30页，共46页，2022年，5月

13、20日，8点15分，星期四三、将目的基因导入受体细胞-植物细胞农杆菌转化法基因枪法花粉管通道法易感染双子叶植物和裸子植物，对大多数单子叶植物没有感染能力第31页，共46页，2022年，5月20日，8点15分，星期四将目的基因导入受体细胞-动物细胞显微注射法第32页，共46页，2022年，5月20日，8点15分，星期四将目的基因导入受体细胞-微生物细胞Ca2+处理 使细胞处于一种能吸收周围环境中的DNA-感受态细胞第33页，共46页，2022年，5月20日，8点15分，星期四四、目的基因的检测与鉴定检测:是否插入目的基因（DNA分子杂交技术）是否转录（mRNA分子杂交技术）是否翻译（抗原抗体杂交

14、技术）鉴定:功能活性鉴定抗性鉴定分别提取什么进行检测归纳步骤第34页，共46页，2022年，5月20日，8点15分，星期四DNA分子杂交示意图 采用一定的技术手段，将两种生物的DNA分子的单链放在一起，如果这两个单链具有互补的碱基序列，那么，互补的碱基序列就会结合在一起，形成杂合双链区；在没有互补碱基序列的部位，仍然是两条游离的单链。 第35页，共46页，2022年，5月20日，8点15分，星期四归纳: 基因工程的基本操作程序获取目的基因从基因文库利用PCR化学方法人工合成构建基因表达载体目的基因、启动子、终止子、标记基因将目的基因导入受体细胞农杆菌转化法、显微注射法目的基因的检测与鉴定检测：

15、是否插入、转录、翻译第36页，共46页，2022年，5月20日，8点15分，星期四第37页，共46页，2022年，5月20日，8点15分，星期四基因操作的基本步骤第38页，共46页，2022年，5月20日，8点15分，星期四基因操作的基本步骤第39页，共46页，2022年，5月20日，8点15分，星期四练习1：(2008理综山东卷)为扩大可耕地面积，增加粮食产量，黄河三角洲等盐碱地的开发利用备受关注。我国科学家应用耐盐基因培育出了耐盐水稻新品系。（1）获得耐盐基因后，构建重组DNA分子所用的限制性内切酶作用于图中的 处，DNA连接酶作用于 处。（填“a”或“b”）aa第40页，共46页，202

16、2年，5月20日，8点15分，星期四练习1：(2008理综山东卷)为扩大可耕地面积，增加粮食产量，黄河三角洲等盐碱地的开发利用备受关注。我国科学家应用耐盐基因培育出了耐盐水稻新品系。（2）将重组DNA分子导入水稻受体细胞的常用方法有农杆菌转化法和 法。（3）由导入目的基因的水稻细胞培养成植株需要利用 技术，该技术的核心是 和 。（4）为了确定耐盐转基因水稻是否培育成功，既要用放射性同位素标记的 作探针进行分子杂交检测，又要用 方法从个体水平鉴定水稻植株的耐盐性。基因枪法（花粉管通道法）植物组织培养脱分化和再分化耐盐基因一定浓度盐水浇灌第41页，共46页，2022年，5月20日，8点15分，星期四1）以下说法正确的是 （ ） A、所有的限制酶只能识别一种特定的核苷酸序列 B、质粒是基因工程中唯一的运载体 C、运载体必须具备的条件之一是：具有多个限制酶切点，以便与外源基因连接 D、基因控制的性状都能在后代表现出来C练习第42页，共46页，2022年，5月20日，8点15分，星期四2）不属于质粒被选为基因运载体的理由是 A、能复制 （ ） B、有多个限制酶切点 C、具有标记基因 D、它是环状DNAD练习第43页，共46页，2022年，5月20日，8点15分，星期四3）有关基因工程的叙述中，错误的是（ ） A、