基因克隆与克隆基因表达

1、关于基因克隆及克隆基因的表达第1页，共83页，2022年，5月20日，8点13分，星期四 一、目的DNA的分离获取（分）分离获取目的DNA有多种方法：(一) PCR待扩增目的基因两端序列已知（据此设计引物）(二) 基因文库先构建，后筛选(三)化学合成法直接合成目的DNA（序列已知、片段较短）第2页，共83页，2022年，5月20日，8点13分，星期四 文库法：一个细胞只接受一个重组DNA分子一般一个载体只携带一段外源DNA 单克隆第3页，共83页，2022年，5月20日，8点13分，星期四 基因组DNA文库（genomic DNA library）：包含某一个生物细胞或组织全部基因组DNA序列

2、的随机克隆群体，以DNA片段的形式贮存了所有的基因组DNA信息。如何从文库中钓取基因？第4页，共83页，2022年，5月20日，8点13分，星期四1234522557294时间（min）温度（）PCR的基本原理PCR反应条件PCR过程PCR的特点适温延伸3高温变性1低温退火2重复13步2530轮目的DNA片段扩增100万倍以上DNA双螺旋DNA单链与引物复性DNA变性形成2条单链子链延伸DNA加倍第5页，共83页，2022年，5月20日，8点13分，星期四PCR的基本原理PCR反应条件PCR过程PCR的特点标准的PCR反应体系4种dNTP混合物 各200umol/L引物 各10100pmol模

3、板DNA 0.12ugTaq DNA聚合酶 2.5uMg2+ 1.5mmol/L第6页，共83页，2022年，5月20日，8点13分，星期四 二、载体的选择与准备（择）；载体（vector）：携带外源DNA，实现外源DNA在受体细胞中的无性繁殖或表达有意义的蛋白质所采用的一些DNA分子。 1.按功能克隆载体（cloning vector）表达载体（expression vector） 2.按基本元件的来源分类：质粒载体噬菌体载体黏粒载体病毒载体人工染色体载体等第7页，共83页，2022年，5月20日，8点13分，星期四 二、载体的选择与准备（择）；（一）根据DNA克隆的目的选择与准备适宜载体1

4、. 获得目的DNA片段选用克隆载体；2. 获得目的DNA片段所编码的蛋白质选用表达载体。（二）考虑目的DNA的大小及受体细胞的种类和来源（三）含有合适的MCS第8页，共83页，2022年，5月20日，8点13分，星期四克隆载体用于外源DNA的克隆和无性繁殖 （一）克隆载体（cloning vector）应具备的主要特点1.至少有一个复制起点（origin of replication, ori）2.至少有一个选择性标志（selection marker）3.有适宜的限制性内切酶的单一切点：多克隆位点（multiple cloning sites，MCS）4.应有较高的拷贝数pBR322质粒图谱

5、 第9页，共83页，2022年，5月20日，8点13分，星期四 克隆载体用于外源DNA的克隆和无性繁殖（二）常用克隆载体的种类1.质粒(plasmid)是最常用的克隆载体广泛存在于细菌、酵母等多种微生物中独立于宿主细胞染色体外的环状双链的超螺旋结构能在宿主细胞内独立自主复制带有某些遗传信息, 会赋予宿主细胞一些遗传性状质粒的不相容性：两个质粒在同一宿主中不能共存的现象。第10页，共83页，2022年，5月20日，8点13分，星期四 目前，已有一系列商品化质粒克隆载体可供选择，可容纳10kb以内的外源DNA 。pUC18/19质粒图谱pUC18/19质粒，2686bp，是最常用的质粒载体缺乏控制

6、拷贝数的rop基因，因此其拷贝数达500-700 第11页，共83页，2022年，5月20日，8点13分，星期四 T-载体：pMD18-T2692bpAmpicillin resistanceoriginHindIIISplnPstIHincIIAccISalIXbalBamHISmaIXmaIKpnISacIEcoRISp6T7LacZTT第12页，共83页，2022年，5月20日，8点13分，星期四 克隆载体用于外源DNA的克隆和无性繁殖（二）常用克隆载体的种类2.噬菌体(phage)能感染细菌的病毒（1）噬菌体DNA改造系统cos位点:两端各有一条由12个碱基组成、彼此完全互补且5突出的

7、序列插入型：gt系列，适用于cDNA克隆置换型：EMBL系列，适用于基因组DNA克隆线性双链DNA分子coscos12bp12bp48500bpNonessential portionfor replicationLong (left) armShort (right) arm（2）M13噬菌体DNA改造系统（含lacZ基因）单链闭合环状DNA分子第13页，共83页，2022年，5月20日，8点13分，星期四 克隆载体用于外源DNA的克隆和无性繁殖（二）常用克隆载体的种类3.穿梭载体(shuttle vector) 可在不同宿主细胞中应用人工构建，含有不止一个复制起点，能携带外源DNA序列在不

8、同种类宿主细胞中复制、扩增。例如，既能在原核生物中复制,又能在真核生物中复制的载体。这类载体不仅具有细菌质粒的复制原点及选择标记基因；还有真核生物的自主复制序列及选择标记性状；具有多克隆位点。通常穿梭载体：在细菌中用于克隆（扩增克隆的基因）， 在酵母菌中用于基因表达分析。第14页，共83页，2022年，5月20日，8点13分，星期四 表达载体用于外源DNA的表达 表达载体（expression vector）：用来在宿主细胞中表达外源基因的载体 依据其宿主细胞的不同可分为: 原核表达载体（prokaryotic expression vector） 真核表达载体（eukaryotic expr

9、ession vector） 第15页，共83页，2022年，5月20日，8点13分，星期四 三、目的DNA与载体连接（接）T4DNA ligase第16页，共83页，2022年，5月20日，8点13分，星期四 四、重组DNA转入宿主细胞进行扩增（转）宿主细胞感受态细胞（competent cell）：处于易于接纳外源物质的状态的细菌第17页，共83页，2022年，5月20日，8点13分，星期四转化（transformation） 质粒或黏粒细菌 质粒酵母（真核细胞）转染（transfection） 外源DNA真核细胞（酵母除外）感染（infection） 噬菌体颗粒细菌 病毒颗粒哺乳细胞 几

10、个相关概念：第18页，共83页，2022年，5月20日，8点13分，星期四 将重组DNA转入受体细胞的常用方法：化学法： 氯化钙法物理法： 电击法 显微注射法 等第19页，共83页，2022年，5月20日，8点13分，星期四 五、重组体的筛选与鉴定（筛）1. 抗生素抗性筛选2. 蓝白筛选3. 限制性内切酶法4. PCR法5. DNA测序法主要方法：第20页，共83页，2022年，5月20日，8点13分，星期四 五、重组体的筛选与鉴定（筛）细胞在含有相应抗生素的培养基中培养：无载体转入的细胞dead；含有载体的细胞alive。1. 利用抗生素抗性标志可筛选出带有载体的重组子尚需进一步鉴定载体是否

11、为含有目的DNA的重组载体第21页，共83页，2022年，5月20日，8点13分，星期四IPTGBlue-white screening of recombinants诱导物半乳糖苷酶Lac Operon ?在指示培养基上用颜色直接筛选重组克隆的方法五、重组体的筛选与鉴定（筛）2. 蓝白筛选 第22页，共83页，2022年，5月20日，8点13分，星期四 3. 限制性内切酶法：根据限制酶切图谱筛选特定DNA五、重组体的筛选与鉴定（筛）Linear vector (2700bp)insert (300bp) M 空质粒 重组质粒NcoIHindIII2700bp300bp提取阳性克隆的重组DNA

12、RE消化电泳有无DNA片段的插入；插入片段的大小连接前用什么酶，就用什么酶切第23页，共83页，2022年，5月20日，8点13分，星期四 可明确序列和阅读框的正确性 5. 核苷酸序列测定是最准确的鉴定目的DNA的方法 五、重组体的筛选与鉴定（筛）利用序列特异性引物，可鉴定阳性克隆。如利用克隆位点两侧序列设计引物进行PCR，再结合序列分析，能可靠地证实插入片段的方向、序列和阅读框的正确性。 4. PCR法：直接鉴定目的DNA的存在第24页，共83页，2022年，5月20日，8点13分，星期四基因克隆技术重组蛋白人源抗体重组多肽药物重组疫苗基因克隆DNA序列测定重组载体基因治疗载体RNA转录载体

13、打靶载体转基因载体基因敲除动物模型转基因动物模型发夹RNARNAi核酸探针标记分子杂交Southern blotNorthern blot构建文库基因组文库cDNA文库基因合成PCR-克隆-亚克隆基因突变基因克隆技术是分子生物学的核心技术 第25页，共83页，2022年，5月20日，8点13分，星期四 克 隆 基 因 的 表 达 获取重组蛋白重组子目的基因的mRNA表达蛋白质第26页，共83页，2022年，5月20日，8点13分，星期四亚克隆（Sub cloning）克隆载体表达载体第27页，共83页，2022年，5月20日，8点13分，星期四原核表达系统Prokaryotic express

14、ion systemEukaryotic expression system真核表达系统大肠杆菌酵母昆虫细胞哺乳动物细胞转化宿主细胞Recombinant vectorpromoterTarget geneProteins Transformation/ Transfection 第28页，共83页，2022年，5月20日，8点13分，星期四原核表达系统： 外源基因引入原核细胞，使其快 速高效表达基因产物。真核表达系统： 外源基因引入真核细胞，使外源 基因在真核细胞中表达。表达体系 第29页，共83页，2022年，5月20日，8点13分，星期四第一部分.外源基因在原核细胞中的表达原核细胞表达系

15、统组成二、原核表达载体一、原核宿主细胞第30页，共83页，2022年，5月20日，8点13分，星期四 大肠杆菌（E.coli)优点：简便, 快速、成本低 可高密度发酵培养20-30min12 hours6-8 Billion bacteriaOnce the recombinant system is established, it is cheap to manufacture.insulinRecombinant一、原核宿主细胞注意：用来克隆基因和表达基因的菌株不一样，表达时，选用与表达载体相匹配的菌株。第31页，共83页，2022年，5月20日，8点13分，星期四生长快，代谢易于控制，可

16、通过发酵迅速获得大量基因表达产物。 基因组结构简单，便于基因操作和分析。 多数原核生物细胞内含有质粒或噬菌体，便于构建相应的表达载体。 生理代谢途径及基因表达调控机制比较清楚。 不具备真核生物的蛋白质加工系统，表达产物无特定的空间构象。 内源蛋白酶会降解表达的外源蛋白，造成表达产物的不稳定性。 原核生物作为基因表达系统的受体细胞具有如下的特点： 第32页，共83页，2022年，5月20日，8点13分，星期四 二、原核表达载体在原核细胞中表达外源基因的载体。质粒：噬菌体：最方便，最常用。长片段原核表达质粒第33页，共83页，2022年，5月20日，8点13分，星期四 强启动子终止子SD序列1、原

17、核表达质粒的元件：oriPT7SDMCSTerminatorProkaryotic Expression Plasmid Prokaryotic promoterLac Istart piontAmpicillin resistance克隆元件：表达元件：复制原点插入位点筛选标记第34页，共83页，2022年，5月20日，8点13分，星期四启动子终止子SDmRNA多肽链利用强启动子，增加蛋白质的生物合成转录起始的速率是基因表达的主要限速步骤，因此，选择强的、可调控启动子是组建一个高效表达载体首先要考虑的问题。 第35页，共83页，2022年，5月20日，8点13分，星期四原核表达载体的启动子都

18、是可诱导的, 目的是在需要目的蛋白的时候才表达它.最理想的可调控启动子应该是：早期阶段：启动子被阻遏当细胞数目达到一定密度时：通过诱导使阻遏物失活，RNA聚合酶快速起始转录。 第36页，共83页，2022年，5月20日，8点13分，星期四Plac： 受Lac阻遏蛋白负调节， 受IPTG的诱导。PL启动子：噬菌体早期 左向启动子。 常用的 原核启动子 PR启动子：噬菌体早期 右向启动子。受噬菌体CI基因调控 第37页，共83页，2022年，5月20日，8点13分，星期四 终止子： 强终止子、二聚体终止子转录过度的危害： 影响目的基因的转录和翻译效率 干扰基因载体的复制等生物学功能 增加受体细胞的

19、无效能量消耗 启动子终止子SDmRNA第38页，共83页，2022年，5月20日，8点13分，星期四成熟型融合型分泌型减少原核细胞对外源蛋白的降解天然完整蛋白融合蛋白分泌性蛋白2、原核表达质粒的类型：第39页，共83页，2022年，5月20日，8点13分，星期四 1）成熟型表达载体oripromoterSDMCSExpression vector特点：外源基因需携带ATG和TAA只表达目的基因编码的氨基酸产生天然蛋白，容易被降解，因此产量小，也可能不稳定。缺点!PForeign DNA 第40页，共83页，2022年，5月20日，8点13分，星期四2) 融合型表达载体载体1：.ATG ACG

20、TCA GAT. 载体2：.ATG NAC GTC AGA T. 载体3：ATG NNA CGT CAG AT.第一种情况：ATGATGNATGNATGNATGNNInsert siteInsert siteInsert site 第41页，共83页，2022年，5月20日，8点13分，星期四第二种情况： 表达载体含有一段编码原核蛋白的基因顺序，使表达的蛋白质N端或C端带着一小段原核多肽。 Protein of interest with a small additional peptide at N or C end.Fig. A schematic structure of fusion

21、protein2) 融合型表达载体第42页，共83页，2022年，5月20日，8点13分，星期四Most popular prokaryotic expression plasmid with his-tag. 融合型表达载体举例第43页，共83页，2022年，5月20日，8点13分，星期四融合蛋白Ni-affinity chromatography if the fused is 6-hisNiNiHis-his-his-his-his-hisIonic bond His-tag Protein可以加入蛋白酶切位点His taqHis taqTAANcoI (ATG)EcoRIHindIII

22、离子键亲和层析第44页，共83页，2022年，5月20日，8点13分，星期四 外源蛋白以融合蛋白的形式表达, 读码框架固定或可选择特点： 小结: 融合型表达载体表达效率高产物稳定 易纯化：利用融合原核多肽的特性 Fusion protein can be purified easily Can be made in large amounts.优点：缺点：非天然蛋白，需要表达后切除融合蛋白第45页，共83页，2022年，5月20日，8点13分，星期四 3)分泌型表达载体 Secretion expression vectorsATG下游构建了信号肽基因序列Secreted into mediu

23、m?(!)E.Coli can not do that第46页，共83页，2022年，5月20日，8点13分，星期四Cell wallCytoplasmic membraneGenome 分泌到细胞周间隙中的重组蛋白质Recombinant protein the space between cell membrane and cell wall. 第47页，共83页，2022年，5月20日，8点13分，星期四The recombinant protein will be secreted into periplasm避免目的蛋白被细菌蛋白酶降解The high expression leve

24、l利于收集外源蛋白优点：读码框架固定: The target gene does not need start codon because it uses the ATG of signal peptide.特点： 第48页，共83页，2022年，5月20日，8点13分，星期四 Single colony50 ml LB medium for 5 hours. OD=0.6 induce foreign gene expression in host.transform recombinant plasmid into expression host cell (BL21DE3)转化平板细菌处

25、于对数生长期时扩大培养留种，然后1/100接种。转化的表达菌要与表达载体相 配套！三、外源基因在E.coli中的表达第49页，共83页，2022年，5月20日，8点13分，星期四IPTG addition IPTG Induction： adding IPTG to the culture if the vector uses Lac operon to regulate foreign gene expression.Quantity of target protein in cell, units 第50页，共83页，2022年，5月20日，8点13分，星期四 Where your exp

26、ressed protein will be located? Inclusion bodies (insoluble) Cytoplasm (soluble)Secreted into periplasmatic space(soluble or insoluble) NothingRecombinant protein may be hydrolyzed by proteinasesresistant to proteinase hydrolysis that results in the high yield 第51页，共83页，2022年，5月20日，8点13分，星期四 SDSPuri

27、fy and Identify the proteinWestern Blot Analysis问题：是不是所有基因都可以在E.coli中表达？第52页，共83页，2022年，5月20日，8点13分，星期四外源基因在原核细胞表达的必要条件：删除内含子和5非编码区外源基因置于强启动子和SD顺序控制下维持正确开放阅读框架（ORF）mRNA稳定且可有效转译，形成的蛋白质不被降解蛋白不需要翻译后加工过程 第53页，共83页，2022年，5月20日，8点13分，星期四真核基因在E.coli中表达应该如何构建？（1）基因片段应该来源于mRNA，因为E.coli不能对基因进行剪接。真核基因原核基因断裂基因连

28、续基因采用RT-PCR法 第54页，共83页，2022年，5月20日，8点13分，星期四（2）尽量将密码子改变成E.coli偏爱密码子，如果有困难，可尝试将基因5端前50个碱基变成偏爱密码子。 E.Coli 核糖体蛋白质的密码子使用频率：第55页，共83页，2022年，5月20日，8点13分，星期四 Case 1. hIFN-2b的表达hIFN-2b的特点：1）一级结构发挥作用，不需要翻译后加工2）经过密码子的改造可以在E.coli中高效表达第56页，共83页，2022年，5月20日，8点13分，星期四Case 2. HBsAg的表达HBsAg的特点：1）高度糖基化E.Coli没有蛋白质加工修

29、饰功能，即使表达出蛋白质也不具备天然蛋白质的功能。2）HBV是真核病毒，因此HBsAg基因含有E.coli的稀有密码子。因此，到目前为止，HBsAg重组疫苗还是在真核CHO细胞或酵母中表达的。 第57页，共83页，2022年，5月20日，8点13分，星期四 真核表达系统的必要性及优势：1. 具转录后加工系统2. 具翻译后修饰系统，重组蛋白具有很好的活性3. 可实现真正的分泌表达4. 基因治疗、研究基因的功能等 原核表达系统的缺点：1. 没有转录后加工系统，不能识别、剪除内含子 2. 缺乏翻译后加工系统，不能对翻译的蛋白质进一步修饰加工 第58页，共83页，2022年，5月20日，8点13分，星

30、期四 真核细胞酵母细胞昆虫细胞哺乳动物细胞酵母表达系统昆虫表达系统哺乳动物细胞表达系统以获得大量的有活性的蛋白为目的研究基因或其蛋白质产物的功能为目的第二部分.外源基因在真核细胞中的表达YeastInsectMammalianEukaryotic Expression System第59页，共83页，2022年，5月20日，8点13分，星期四 一、酵母表达系统系统组成： 酵母细胞 酵母质粒表达载体比细菌菌落大而厚，菌落表面光滑湿润、粘稠、容易挑起，质地、颜色均一，多为乳白色*低等真核单细胞生物，生长快，可大规模发酵培养, 成本较低。*可以进行一定程度的蛋白质翻译后修饰。1.酵母细胞：第60页，

31、共83页，2022年，5月20日，8点13分，星期四 大肠杆菌/酵母菌穿梭载体 ：1. 在E.coli中复制与筛选 *pUC ori , Ampr2. 在酵母细胞象细菌中质粒一样复制（2u origin）3. 在酵母细胞中表达外源基因 *酵母可识别的启动子4. 筛选标记： 营养缺陷筛选 URA32. 酵母质粒表达载体第61页，共83页，2022年，5月20日，8点13分，星期四 二、昆虫表达系统昆虫病毒：baculovirus转递质粒载体1、可对蛋白质进行翻译后加工修饰2、可高水平表达外源基因产物3、操作相对简单已经商品化4、蛋白准确定位如分泌到膜外。载体：昆虫表达系统的组分：昆虫细胞 优点：

32、第62页，共83页，2022年，5月20日，8点13分，星期四病毒基因组相对较大，不宜直接将外源基因克隆到病毒基因组。 the polyhedrin gene becomes unnecessary. replace polyhedrin coding seq with gene of interest (G of I)Baculovirus genomestrong PromoterPolyhedrin gene昆虫病毒昆虫表达载体：提供目的基因的质粒载体昆虫杆状病毒. 第63页，共83页，2022年，5月20日，8点13分，星期四 *首先将外源片段克隆到某质粒上，再以某种机制将外源片段递到

33、病毒基因组上有两种不同原理构建的昆虫表达系统：1）根据同源重组原理构建的2）根据转座子原理构建的，如Bac-To-Bac表达系统昆虫表达载体：提供目的基因的质粒载体第64页，共83页，2022年，5月20日，8点13分，星期四 -转座子机制：如Bac-To-Bac表达系统Bacmid - insect cellBacmidPolyhedrin promoter将转座子的靶点构建到昆虫病毒基因组上（Baculovirus plasmid） 带有杆状病毒基因组的质粒，可在细菌和昆虫细胞之间穿梭 第65页，共83页，2022年，5月20日，8点13分，星期四 是否还记得转座子是在染色体间运动？转座子

34、(trans-poson,Tn)是存在于染色体DNA上可自主复制和位移的基本单位。可在细菌的染色体，质粒或噬菌体之间自行移动的遗传成分，是基因组中一段特异的具有转位特性的独立的DNA序列。 第66页，共83页，2022年，5月20日，8点13分，星期四 *将转座子的两个臂构建到MCS两侧。1.构建重组转递质粒*通过基因克隆的方法将外源片段克隆到转递质粒上。庆大Ppolh真核筛选标记基因 promoter of Polyhedrin G of I are flanked with two arms of a transposon.第67页，共83页，2022年，5月20日，8点13分，星期四 2

35、 Recombinant bacmid DNA主要是LacZ , Kanr , oriE Baculovirus genome pFastBac1Tn7LPpolhForeign geneAttachment sitehelperCompetent DN10Bac E.coliTransformationhelperForeign genePpolhE.coli containing recombinant BacmidPpolhMini-prep of high molecular weight DNA2. To construct recombinant Bacmid DNA based

36、on transposition mechanism in E.coli.1 Recombinant donor plasmidHelper质粒编码转座酶TetramprTn7RTet Kan , 庆大 Blue-White selection 庆大Transposition Bacmid（23天）第68页，共83页，2022年，5月20日，8点13分，星期四Isolated recombinant bacmid DNAthen transfect insect cells with lipo-insect4. Viral amplyfication: harvest the supernat

37、ant and infect insect cells for 5times5. recombinant protein: Expressed by insect cells is in supernantant while viral amplificates. 3. Bacmid will be packaged into viral particle in insect cell. Reconbinant baculoverus particle is released into the supernatant. Infect other cell.Recombinant bacmid

38、particles 第69页，共83页，2022年，5月20日，8点13分，星期四感染前感染后 第70页，共83页，2022年，5月20日，8点13分，星期四三、哺乳动物细胞表达系统系统组成：宿主细胞：哺乳动物细胞* 表达最接近天然的重组蛋白质* 重组蛋白的产量较低* 直接利用宿主细胞研究重组蛋白的功能* 可用于基因治疗表达载体：* 哺乳动物细胞质粒表达载体* 动物病毒 第71页，共83页，2022年，5月20日，8点13分，星期四 哺乳动物细胞质粒表达载体eukaryoticMCSPoly A signalterminatorNeor第72页，共83页，2022年，5月20日，8点13分，星期四 酵母细胞昆虫细胞哺乳动物细胞质粒昆虫杆状病毒质粒或病毒重组蛋白质产物:产率翻译后修饰活性载体目的基因优选cDNA 真核细胞表达系统的比较 Yeast system limited post-translational modifications grow readily in simple medium第73页，共83页，2022年，5月20