原生质体的培养与融合

1、第十一章 原生质体的培养与融合第一页，共四十九页。原生质体的分离与纯化原生质体培养原生质体融合本章主要内容第二页，共四十九页。 原生质体（Protoplast）含义：去掉细胞壁的由质膜包裹、具有生活力的裸露细胞。第三页，共四十九页。微 丝叶绿体线粒体质 膜细胞核内质网微 管细胞壁高尔基体植物细胞模式图液 泡第四页，共四十九页。第一节 原生质体分离及纯化一、原生质体分离双子叶外植体胚性细胞第五页，共四十九页。多数植物分离原生质体的经典材料-叶肉细胞。（一）材料来源禾本科植物： 愈伤组织或悬浮细胞。第六页，共四十九页。（二） 分离方法机械分离法酶法分离法第七页，共四十九页。1、机械分离法（Mach

2、anical isolation）优点：（1）能排除酶的有害影响；缺点：（1）原生质体的产量低；（2）方法繁琐费力；（3）局限性大第八页，共四十九页。（1）酶的种类纤维素酶类（Cellulase） 果胶酶类（Pectolyase）半纤维素酶类（Hemicellulase）崩溃酶蜗牛酶2、酶法分离（Enzymatic isolation）第九页，共四十九页。第十页，共四十九页。（2）酶液的配制渗透压稳定剂及pH酶的配比及浓度果胶酶：浓度不宜超过2%, 纤维素酶(1-2%)渗透压稳定剂:（500600mmol/L甘露醇)第十一页，共四十九页。（3）分离原生质体两步分离法一步分离法方法有二：叶肉原生

3、质体分离提纯第十二页，共四十九页。图示原生质体分离过程（以叶片为例）过滤、离心加果胶酶和纤维素酶第十三页，共四十九页。叶片愈伤组织第十四页，共四十九页。二、 原生质体纯化与活力测定（一）原生质体纯化方法三种离心沉淀法漂浮法界面法第十五页，共四十九页。1、 离心沉淀法原理：应用原生质体的比重大于溶液，离心后原生质体沉于底部。步骤：第一步原生质体溶液用400目网筛过滤。第二步离心（500-1000r/min，离心5-6min）。第三步吸去上清液，洗涤液重新悬浮，再离心沉淀。如此2-3次。第四步用原生质体培养液洗1次，收集原生质体。第十六页，共四十九页。2、漂浮法原理：应用渗透剂含量较高的洗涤液使原

4、生质体漂浮在液体的表面。步骤：第一步：400目网筛过滤。第二步：滤液和高渗溶液混合，离心。第三步：小心吸取上层原生质体，洗涤液重复洗2-3次。第四步：收集溶液表面原生质体，用培养液洗1次。第十七页，共四十九页。 3 、 界面法25%蔗糖溶液13%甘露醇溶液原理：选两种不同渗透浓度的溶液，其中一种溶液密度大于原生质体的密度，另一种溶液小于原生质体的密度。第十八页，共四十九页。（二） 原生质体活力测定1、形态识别：形态上完整，呈圆形，含有饱满的细胞质，颜色鲜艳的即为存活的原生质体。2、染色识别1）0.1%酚番红染色：有活力的不被染色，死亡的被染上色。2）0.025%Evans蓝染色：有活力但受损伤

5、的细胞和死细胞能够摄取这种染料，活细胞不摄取 2）双醋酸盐荧光素(FDA)染色法：在荧光显微镜下有荧光的即为有活性的原生质体。第十九页，共四十九页。第二节 原生质体培养一、培养基pH渗透压钙源生长物质氮源碳源培养基第二十页，共四十九页。二、培养方法培养方法液体浅层培养平板培养法双层培养法饲养层培养法第二十一页，共四十九页。肉眼可见细胞团愈伤组织器官发生途径胚胎发生途径植株植株再生途径第二十二页，共四十九页。定义：原生质体融合也叫做体细胞杂交，使分离出来的不同亲本的原生质体，在人工控制条件下，相互融合成一体，形成杂种细胞，并进一步发育成杂种植株的技术。第三节 原生质体融合第二十三页，共四十九页。

6、原生质体融合第二十四页，共四十九页。一、原生质体融合意义克服杂交不亲合克服生殖器官败育克服多胚现象第二十五页，共四十九页。第二十六页，共四十九页。番茄+马铃薯第二十七页，共四十九页。二、融合方法 无机盐诱导融合 高pH-高Ca离子 聚乙二醇(PEG)法 PEG结合高钙-高pH诱导法 电融合技术第二十八页，共四十九页。(一)无机盐诱导融合: NaNO3法1972年： Carlson诱导原生质体融合获得首例杂种植株粉蓝烟草和朗氏烟草体细胞杂种。NaNO3的作用：中和质膜的负电荷，使原生质体不再相互排斥，而紧密结合在一起不足：诱导频率不高。第二十九页，共四十九页。 1973年：Keller用pH10

7、.5的50 mM CaCl2溶液在37时，诱发烟草叶肉原生质体融合。优点：杂种产量高。不足：高pH值对细胞有毒害作用。（二）高pH-高Ca离子法第三十页，共四十九页。PEG法特点：融合频率高可重复性强诱发融合无特异性毒性较低植物+植物植物+动物动物+酵母Polyethylene Glycol（聚乙二醇）（三）PEG法第三十一页，共四十九页。PEG法原理PEG是一种带负电性的高分子化合物，在原生质体融合中起到一种桥梁作用，可以使原生质体凝聚。在洗脱过程中，PEG将被洗掉，导致质膜表面电荷重排。粘连的质膜大面积紧密相连，电荷的重排导致一个原生质体的负性电荷部位与另一原生质体的正性电荷部位相连而导致

8、融合。第三十二页，共四十九页。PEG法示意图-+-桥梁+-PEG被洗掉+-+-电荷重排+-+-+-+-膜接触第三十三页，共四十九页。最为常用。具体做法：在无菌条件下混合双亲原生质体-滴加PEG溶液，摇匀，静置-滴加高钙-高pH溶液，摇匀，静置-滴加原生质体培养液洗涤数次-离心获得原生质体细胞团-筛选-再生杂合细胞（四）PEG结合高钙-高pH诱导法第三十四页，共四十九页。(五)电融合技术Senda 首先用此方法实现原生质体融合细胞融合仪第三十五页，共四十九页。电融合法原理交流电场使原生质体表面电荷偶极化，沿着电极排列，形成串珠。+-负极正极+-+-+-+-+-+-+-+-第三十六页，共四十九页。

9、施加直流电场后，形成串珠的原生质体在质膜接触处发生穿孔，开始遗传物质的交流。+-+-+-+-+-+-+-+-第三十七页，共四十九页。原生质体的融合过程：第三十八页，共四十九页。三、体细胞杂种细胞筛选与鉴定1互补选择法2、机械分离杂种细胞法3. 双荧光标记选择法第三十九页，共四十九页。第四十页，共四十九页。异硫氰酸荧光素（FITC）：绿色异硫氰酸罗丹明（RITC）：红色3. 双荧光标记选择法第四十一页，共四十九页。第四十二页，共四十九页。四、体细胞杂种植株的鉴定 形态学鉴定 细胞学观察 DNA多态性分析 同工酶分析第四十三页，共四十九页。4-1、形态学鉴定第四十四页，共四十九页。4-2、细胞学观

10、察染色体形态和数目的比较18条染色体36条染色体第四十五页，共四十九页。4-3 DNA多态性分析RAPD带型（随机扩增的多态性DNA）第四十六页，共四十九页。 4-4 同功酶鉴定根据亲本和杂种同功酶谱的差异来鉴别杂种。有的呈双亲谱带的总和、有的出现新谱带或丢失部分亲本谱带。常用的鉴定酶为：乙醇脱氢酶、乳酸脱氢酶、过氧化物酶、酯酶等。第四十七页，共四十九页。(1) 原生质体培养的意义：(2) 原生质体分离方法：机械分离法、酶法分离。 (3) 原生质体的纯化方法：离心沉淀法；漂浮法；界面法。(4)原生质体活力的测定：形态识别；染色识别。(5)原生质体培养方法：液体浅层培养；平板法培养；悬滴法培养；双层培养法；饲