分子生物学5-1课件

1、第五章 分子生物学研究法（上） DNA、RNA及蛋白质操作技术第五章 DNA、RNA及蛋白质操作技术本章主要内容一、重组DNA技术回顾二、 DNA基本操作技术三、RNA基本操作技术四、SNP的理论与应用五、基因克隆技术六、蛋白质组与蛋白质组学技术一、重组DNA技术回顾分子生物学的三大成就40年代确定了遗传信息的携带者，即基因的分子载体是DNA而不是蛋白质，解决了遗传的物质基础问题；50年代提示了DNA分子的双螺旋结构模型和半保留复制机制，解决了基因的自我复制和世代交替问题；50年代末至60年代，相继提出了中心法则和操纵子学说,成功地破译了遗传密码，充分认识了遗传信息的流动和表达。 第五章 DN

2、A、RNA及蛋白质操作技术重组DNA的核心是用限制性内切核酸酶（restriction endonuclease，RE）和DNA连接酶对DNA分子进行体外切割与连接。工具酶的发现和应用被认为是现代生物工程技术史上最重要的事件（P156 表51）。重组DNA技术：是在生物体外，通过对DNA分子进行人工“剪切” 和“拼接”，对生物的基因进行改造和重新组合，然后导入受体细胞内进行无性繁殖，使重组基因在受体细胞内表达，产生出人类所需要的新的生物类型和生物产品。第五章 DNA、RNA及蛋白质操作技术基因的剪刀（分子手术刀） 限制性核酸内切酶（限制酶）基因的针线（分子缝合针） DNA连接酶基因的运输工具（

3、分子运输车） 运载体第五章 DNA、RNA及蛋白质操作技术Hin d ：AAGCTT TTCGAA A AGCTT TTCGA AEco R：GATATC CTATAG GAT ATC CTA TAG第五章 DNA、RNA及蛋白质操作技术特殊性质的限制酶同裂酶（异源同工酶）：指来源不同，但具有相同的识别序列。在切割DNA时，其切割点可以是相同的，产生平头末端，称为同识同切；切割点也可以是不同的，产生3或5粘性末端，称为同识异切。同尾酶：指来源不同，但识别与切割顺序有一定的相关性的一类酶，它们作用后产生相同的粘性末端。可变酶：识别顺序中的一个或几个碱基是可变的，并且识别顺序往往超过6个碱基对。B

4、stp，其识别顺序为GGTNACC。第五章 DNA、RNA及蛋白质操作技术3、运载体作用：将外源基因送入受体细胞。具备的条件：能在宿主细胞内复制 ，并稳定地保存；具有多个限制酶切点；具有遗传表型或筛选标记可导入受体细胞，对受体细胞无害。第五章 DNA、RNA及蛋白质操作技术举例：质粒、噬菌体和动植物病毒。克隆载体用来克隆和扩增DNA片段的载体。有质粒DNA、噬菌体DNA和病毒DNA三类。 表达型载体为了使插入的外源DNA能够表达为多肽链而设计的载体称为表达型载体。表达型载体除需载体必备条件外，还需相应的启动子、核糖体结合位点、增强子、终止子等表达调控构件。第五章 DNA、RNA及蛋白质操作技术

5、pBR322质粒第五章 DNA、RNA及蛋白质操作技术 噬菌体两种生长途径（示意图）第五章 DNA、RNA及蛋白质操作技术载 体 的 构 建 过 程二、 DNA基本操作技术1、核酸凝胶电泳技术1.1 原理将某种分子放到特定的电场中，它就会以一定的速度向适当的电极移动。某物质在电场作用下的迁移速度叫作电泳的速率，它与电场强度成正比，与该分子所携带的净电荷数成正比，而与分子的磨擦系数成反比（分子大小、极性、介质的粘度系数等）。在生理条件下，核酸分子中的磷酸基团是离子化的，所以，DNA和RNA实际上呈多聚阴离子状态（Polyanions）。将DNA、RNA放到电场中，它就会由负极正极移动。第五章 D

6、NA、RNA及蛋白质操作技术1.2 常用固体支持介质琼脂糖（agarose）和聚丙烯酰胺（polyarylamide）都属于固体支持介质，使用支持介质的目的是防止电泳过程中的对流和扩散，使得被分离的成分得到最大的分辨率。固体支持介质可以形成复杂的网孔结构，DNA要穿过这些网孔才能到达正极，因此分子量小，结构致密的DNA分子就更容易穿过这些网孔，泳动的速度也越快。琼脂糖是一种从红色海藻产物琼脂中提取出的线性多糖聚合物，经化学修饰后形成低熔点琼脂糖，常用于DNA片段制备的电泳。第五章 DNA、RNA及蛋白质操作技术低熔点（LMP）的琼脂糖是一种熔点为6265 的琼脂衍生物，它一旦熔解，便可在37下

7、持续保持液体状态达数小时之久，而在25下也可持续保持液体状态约10分钟。LMP琼脂糖可以不经电洗脱或破碎凝胶，即可用来回收DNA分子。第五章 DNA、RNA及蛋白质操作技术琼脂糖和聚丙烯酰胺凝胶分辨DNA片段的能力第五章 DNA、RNA及蛋白质操作技术凝胶类型及浓度分离DNA片段的大小范围（bp）0.3%琼脂糖5000010000.7%琼脂糖2000010001.4%琼脂糖60003004%聚丙烯酰胺1000 10010%聚丙烯酰胺500 2520%聚丙烯酰胺50 1DNA大小与迁移距离的关系 在一定范围内，DNA分子迁移的距离与其核苷酸对（bp）的对数成反比。第五章 DNA、RNA及蛋白质操

8、作技术DNA分子的状态与迁移速度的关系在无EB下电泳，cccDNA泳动速度最快，linear DNA次之，ocDNA最慢。随着EB浓度的增加，更多的EB结合到DNA上，cccDNA分子的负超螺旋逐渐解开，其分子半径增加，迁移速率减小。达到游离染料的临界浓度时，不再有超螺旋，cccDNA分子的迁移速率达最小值。继续增加EB，便形成正超螺旋，DNA分子变得更加致密，迁移速率迅速增加。对绝大多数cccDNA分子而言，游离EB的临界浓度介于0.10.5g/ml。由于电荷的中和，以及EB赋予DNA较大的刚性，随着EB浓度的增加，linearDNA和ocDNA的迁移速率也有不同程度的减小。第五章 DNA、

9、RNA及蛋白质操作技术染色 在凝胶电泳中，一般加入溴化乙锭（EB）-ethidium bromide染色，此时，核酸分子在紫外光下发出荧光，肉眼能看到约50ng DNA所形成的条带。第五章 DNA、RNA及蛋白质操作技术银染银染色:银染色液中的银离子(Ag+)可与核酸形成稳定的复合物，然后用还原剂如甲醛 使Ag+还原成银颗粒，可把核酸电泳带染色黑褐色.主要用于聚丙烯酰胺凝胶电泳染色. 也用于琼脂糖凝胶染色.其灵敏度比EB高200倍.但银染色后，DNA不宜回收 。第五章 DNA、RNA及蛋白质操作技术大分子DNA的电泳分离在常规琼脂糖凝胶电泳中，有效分离天然DNA分子的大小最大只能到1520kb

10、。更大的线状双链DNA分子在琼脂糖凝胶中的迁移速率相同。此时凝胶不能再按分子大小分离DNA，而是在单向恒定电场的作用下，仅以“一端向前”的方式游动穿过整个胶板。第五章 DNA、RNA及蛋白质操作技术脉冲电泳(PFGE-Pulse-field gel electrophoresis)1983年，Schwartz等提出了脉冲电场凝胶电泳 (PFGE) 的设计思想，从而找到了解决这一问题的办法。这一方法在凝胶上外加正交的交变脉冲电场。每当电场方向改变后，大DNA分子便滞留在爬行管里，直至沿新的电场轴向重新定向后，才能继续向前移动。若DNA分子变换方向的时间小于电脉冲周期时，DNA分子就可以按其大小分

11、开。分子越大，转向所需的时间越长，总的迁移距离就越短，从而达到分离的目的。第五章 DNA、RNA及蛋白质操作技术脉冲电场凝胶电泳 (PFGE)的种类垂直脉冲场电泳系统(vertical pulsed field)场翻转系统(field inversion)旋转胶系统(rotating gel)箝位匀强电场系统(contour-clamped homogeneous electric field)第五章 DNA、RNA及蛋白质操作技术影响分辨率的因素脉冲时间（0.1s-1000s)：增加脉冲时间分离较大分子，减少脉冲时间分离较小分子。电压：若固定脉冲时间，增加电场强度就增大了可分离最大片段的范围

12、，但是太大的电场强度会导致较小片段泳动的紊乱。电场夹角：电场方向的夹角常为1100 - 1200，研究证实900夹角也非常有效的。温度：标准琼脂糖电泳基本在室温进行，PFGE一般应在4 进行。较高的温度DNA泳动较快；但是较高的温度也引起较小片段的泳动截留和明显的条带变宽。第五章 DNA、RNA及蛋白质操作技术2、细菌转化与目标DNA分子的增殖细菌转化（transformation）：指一种细菌菌株由于捕获了来自供体菌株的DNA而导致性状特征发生遗传改变的过程。提供转化DNA的菌株叫供体菌株，接受转化DNA的菌株叫受体菌株。在基因克隆中，需要扩增的DNA片段连接到载体(vector)上，再将重

13、组的载体导入宿主细胞中，重组载体在宿主细胞中复制，目的DNA片段也同时得到扩增。 第五章 DNA、RNA及蛋白质操作技术绝大多数细菌，包括大肠杆菌（E.coil），正常条件下仅能获取少量的DNA，因此，为了提高转化效率，必需对受体细菌进行物理或化学处理，以增加它们获取DNA的能力。这种处理过的细胞称为感受态细胞。细菌转化常用的方法：CaCl2法电击法三亲交配法第五章 DNA、RNA及蛋白质操作技术大肠杆菌培养基 液体培养基（LB液体培养基：1g蛋白胨，0.5g酵母粉，1g NaCl，加重蒸水100ml，用NaOH调pH至7.0，高压灭菌。）、固体培养基（在液体培养基的基础上加琼脂或琼脂糖）。

14、有些培养基需要加一些不耐高温的成分，应在培养基高压灭菌后冷却到一定温度再加入，这些成分的母液可通过过滤除菌。第五章 DNA、RNA及蛋白质操作技术在液体培养基中生长 用于转化的大肠杆菌受体菌应采用对数期的细菌；用于提取质粒的应采用饱和期的细菌。在经预备实验测出生长曲线后，通过测定培养液的O.D.600就可以知道液体培养基中的细菌处于什么期。 第五章 DNA、RNA及蛋白质操作技术2.1 CaCl2法CaCl2法是制备大肠杆菌感受态最常用的方法。将快速生长的大肠杆菌置于经低温（ 0 ）预处理的低渗CaCl2溶液中，会造成细胞膨胀，细胞膜的通透性发生变化，极易与外源DNA相黏附并在细胞表面形成复合

15、物。此时，将该体系转移到42下热激90s，外源DNA就可能被细胞吸收。CaCl2法关键点：细菌必须处于生长对数期实验操作必须在低温下第五章 DNA、RNA及蛋白质操作技术2.2 电击法（electroporation）在高压脉冲下，细菌细胞表面形成暂时性微孔，重组DNA进入微孔后，脉冲结束，细胞恢复。实验简单，不需要制备感受态菌，转化效率高1091010/ug原理利用高压脉冲，在细菌细胞表面形成暂时性的微孔，重组DNA从微孔中进入，脉冲过后，微孔复原，在丰富培养基中生长数小时后，细胞增殖，重组DNA得到大量复制。第五章 DNA、RNA及蛋白质操作技术第五章 DNA、RNA及蛋白质操作技术2.3

16、 三亲本杂交结合法部分质粒含有tra基因，指令宿主细胞（如大肠杆菌）产生菌毛（pilus），合成细胞表面物质，促使宿主细胞与受体细胞接合，导致遗传物质从一细胞转移到另一细胞中。含tra基因的质粒称为接合质粒（conjugative plasmid）。一般来说，接合质粒分子较大，拷贝数较少，并且宿主广，比较不安全，不宜用作外源基因的载体。不含tra基因的质粒称为非接合型质粒（non-conjugative plasmid），这类质粒分子小，拷贝数多，不会自行接合转移，比较安全。因此，用于构建克隆载体的质粒一般是非接合型质粒。第五章 DNA、RNA及蛋白质操作技术 三亲本杂交（tri-parent

17、al mating）接合转化法是基于非接合型质粒的迁移作用（mobilization）而建立的一种DNA转化方法，此法尤其适用于那些难以采用CaCl2诱导转化法或电穿孔法等进行重组DNA分子直接转化的受体菌。非接合型质粒不能像接合型质粒那样在宿主细胞间自我转移，但如果在宿主细胞中存在另外一种相容性的接合型质粒（此处称之为辅助质粒），非接合型质粒通常也会被转移，这种由共存的接合型质粒引发的非接合型质粒的转移过程称为迁移作用。第五章 DNA、RNA及蛋白质操作技术导入真核细胞的方法CaCl2转化电击法磷酸钙-DNA共沉淀法DEAE-葡聚糖介导转染脂质体法显微注射法基因枪法农杆菌介导法第五章 DNA

18、、RNA及蛋白质操作技术重组质粒的鉴定和筛选抗生素平板筛选（插入失活）半乳糖苷酶蓝白筛选小量制备载体DNA作限制酶切分析Southern 印迹杂交分析菌落或噬菌斑原位杂交分析Spi 筛选第五章 DNA、RNA及蛋白质操作技术抗生素平板筛选（插入失活）第五章 DNA、RNA及蛋白质操作技术Lac操纵子调控模型第五章 DNA、RNA及蛋白质操作技术互补的原理现在使用的许多载体都带有一个大肠杆菌DNA的短区段，其中含有半乳糖苷酶基因（lacZ）的调控序列和头146个氨基酸（肽）的编码信息。这个编码区中插入了一个多克隆位点，它并不破坏阅读框，但可使少数几个氨基酸插入到半乳糖苷酶的氨基端，而不影响功能。

19、第五章 DNA、RNA及蛋白质操作技术互补的原理这种载体适用于可编码半乳糖苷酶 C 端部分序列的宿主细胞。虽然宿主和质粒编码的片段各自都没有酶活性，但这两个肽段可以融为一体，形成具有酶学活性的半乳糖苷酶。这种互补叫做互补。半乳糖苷酶能将无色的x-gal（5-溴-4-氯-3-吲哚-D-半乳糖苷）转变成蓝色的5-溴-4-氯靛蓝，用这种方法可方便地检测出该酶活性的存在。第五章 DNA、RNA及蛋白质操作技术互补的应用当外源DNA插入到载体 lacZ 的多克隆位点上后， 破坏了肽，从而不能发生互补，不能产生有活性的半乳糖苷酶。当培养基中存在IPTG（异丙基-D-硫代半乳糖苷）和x-gal时，由携带了外

20、源DNA的重组载体转化的细胞长成白色菌落（或无色噬菌斑），而由没有携带外源DNA的空白载体转化的细胞长成蓝色菌落（或蓝色噬菌斑）。第五章 DNA、RNA及蛋白质操作技术第五章 DNA、RNA及蛋白质操作技术限制性内切酶图谱、PCR分析第五章 DNA、RNA及蛋白质操作技术重组体DNA分子的外包装法利用噬菌体颗粒能够有效的将DNA注入宿主细胞，发明了重组体DNA分子的外包装法。噬菌体DNA分子可分为3个区。左臂区含有编码头部和尾部结构的蛋白基因，右臂区含有负责DNA复制、使宿主细胞裂解的基因，以及这些基因表达的调控序列。中央区的基因对于形成噬菌体是不必需的，这一段可被外源DNA取代。第五章 DN

21、A、RNA及蛋白质操作技术环状分子左臂 左臂 右臂右臂中央区中央区（40%）Cos位点将噬菌体改建成载体的措施消除基因组必需区内不必要的限制性内切酶酶切位点。在可替代区构建所需的酶切位点。可在外源DNA插入位点之前加入适当的启动子，以表达外源DNA。加入易检测的表型基因（如 lacZ）。重组噬菌体最好能够包装，以增加转导率。第五章 DNA、RNA及蛋白质操作技术在载体中，只有单个切点供外源DNA插入的叫插入型载体（insertion vectors）；那些具有成对的切点，且切点间的片段又可被除去并被外源DNA取代的载体叫取代型载体或替换型载体（replacement vectors）。第五章

22、DNA、RNA及蛋白质操作技术3、聚合酶链式反应聚合酶链反应（Polymerase chain reaction，PCR）是一种体外扩增DNA片段的方法，与用载体和宿主细胞的体内扩增相比，有简便、快速的优点，并有许多特殊的用处。其原理是：以DNA的一条链为模板，在有RNA引物、4种脱氧核苷酸（dNTP）时，和DNA聚合酶的条件下，在引物所结合的位置向3方向合成新的互补链。其反应以双链DNA的变性、退火、延伸为一个循环。经过多次循环（25-30次），便目标DNA片段得以大量扩增。由于每一次循环所产生的新链均可成为新的模板用于下一轮循环，故PCR产物以指数方式增加。第五章 DNA、RNA及蛋白质操

23、作技术第五章 DNA、RNA及蛋白质操作技术PCR原理图 PCR反应的体系DNA模板一对引物耐热的DNA聚合酶4dNTP缓冲液Mg2+、K+离子酶活性保护剂第五章 DNA、RNA及蛋白质操作技术PCR仪PCR仪实际上就是一种温度循环仪，它能够快速地升降温和保持恒温，全部由电脑控制。常用的反应容器有0.2ml的薄壁Eppendorf管和毛细玻璃管。第五章 DNA、RNA及蛋白质操作技术对DNA模板的要求对DNA模板纯度的要求不很高，但必须除去DNA聚合酶抑制剂。理论上有一个DNA模板分子就可以扩增出大量的产物，实际上使用pgng级的模板量。模板一般是双链分子，也可以是单链分子。模板DNA分子不宜

24、太长，可用切点稀少的限制酶切成较短的片段。由于环状DNA模板的扩增效率较线状DNA模板低，所以最好先将环状DNA用限制酶切成线状再行扩增。RNA模板应先逆转录成cDNA再进行PCR扩增。第五章 DNA、RNA及蛋白质操作技术引物长度一般为1530个核苷酸。引物太短与模板结合的位点特异性差，引物太长与模板结合的速率下降，影响PCR的效率。不应有超过3个连续的C或G。引物自身不存在互补序列，两个引物之间也不能有超过4个连续碱基互补的情况，G+C含量为40-60。当引物的3端有足够长与模板互补的序列时，引物的5端可以不与模板互补，利用这点可在PCR产物的两端加上特殊序列（如限制性内切酶位点）。第五章

25、 DNA、RNA及蛋白质操作技术BamH I4. 为了方便PCR产物的检测和分析，可以在引物的5端以同位素或非同位素修饰（32P、荧光素、生物素等）。5. 当要扩增的DNA序列不知，但知其编码的氨基酸序列，可反推出DNA序列，为设计引物提供依据。因简并密码的存在，反推出的DNA序列是不唯一的，这时应采用简并引物。常用的引物设计软件：Oligo，Primer第五章 DNA、RNA及蛋白质操作技术Taq DNA聚合酶现在常用的Taq酶，在95的变性温度下（20秒），经过50次循环仍保持65 %的酶活性。对于Taq酶的聚合酶活性来说，最佳作用温度为7580，60时聚合酶活性仅剩1/2，37时聚合酶活性仅剩1/10。但在许多情况下，需要在低于最适温度条件下进行聚合反应，以免引物从模板上解离下来。 Taq酶有53的聚合