生物化学I 第三章 酶学课件

1、 第三章 酶 Enzyme姓名：赵 鹏生命科学学院 生物科学系 西部资源生物与现代生物技术教育部重点实验室 Biochemistry 目 录第一节 酶的概述第二节 酶的命名与分类第三节 酶的作用机理第四节 影响酶促反应速度的因素第五节 几种重要的调节酶第六节 酶的分离提纯与酶活力测定第七节 酶工程与酶的应用第一节 酶的概述 酶是由生物体活细胞产生，在细胞内、外均有催化活性且具有高度专一的蛋白质，亦称生物催化剂。 绝大多数酶都是蛋白质；1983年发现某些RNA分子具有催化活性，对有催化 活性的RNA称为核酶。酶催化的生物化学反应，称为酶促反应。在酶的催化下发生化学变化的物质，称为底物，反应后生成

2、的物质成为产物。一、酶的概念：2. 1857年，Pasture提出乙醇发酵是活的酵母细胞活动的结果。微生物学家分子在酵母细胞中运行3. 1833年，Payon和Persoz从麦芽提取液中分离到一种能水解淀粉的物质，淀粉酶制剂。麦芽淀粉酶制剂5. 19301936年，Northrop和Kunitz先后得到了胃蛋白酶、胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶结晶，并用相应方法证实酶是蛋白质。为此， Northrop和Kunitz于1949年共同获得诺贝尔奖。胃蛋白酶胰凝乳蛋白酶 与一般催化剂的相同点: 1.反应前后质与量不变，且用量少。 2.缩短到达平衡的时间，不改变平衡点。 3.只能催化本来进行的反应。 4.降低

3、反应所需活化能。二、酶的催化特点酶的催化作用特点1. 高效：比一般催化剂高1061013倍. 1 mol/L过氧化氢酶1秒钟可分解105 mol/L底物,1mol/L铁离子1秒钟可分解10-5 mol/L底物(75.448.98.4kJ/mol)。2. 高度的专一性 ：酶对底物及其催化的反应有严格的选择性。 3. 反应条件温和：一般要求在常温、常压、中性酸碱度 等温和条件下进行。否则会失去活性。4. 活性可调控：生物体内反应多，但非常协调有序。5. 有些酶需辅助因子：有些酶是结合蛋白质，其中小分子物质辅因子与酶催化活性密切相关。酶蛋白 (apoenzyme) ：多肽；决定特异性、高效性辅助因子

4、(cofactor)：非蛋白组分；递氢、电子、基团；决定反应类型、性质全酶(holoenzyme)2、结合酶的组成成分辅基(Prosthetic group)：与酶蛋白结合牢固，不能用透析等简单方法与酶蛋白分离的有机小分子 辅酶(Coenzyme): ：与酶蛋白结合不牢固，能用透析等简单方法与酶蛋白分离的有机小分子。 （二）单体酶、寡聚酶、多酶复合体单体酶：只有一条多肽链寡聚酶：由两个或两个以上亚基组成的酶 成为寡聚酶。具有多条多肽链多酶复合体：由几种酶彼此靠共价键嵌合而成的复合体。四、酶的底物专一性 （一）绝对专一性 有的酶对底物的化学结构要求非常严格，只作用于一种底物，不作用于其它任何物质

5、。 （NH2)2CO+H2O 尿酶 2NH3+CO2 （二）相对专一性 有的酶对底物的化学结构要求比上述绝对专一性略低一些，它们能作用于一类化合物或一种化学键。 1） 键专一性 2） 基团专一性1） 键专一性有的酶只作用于一定的键，而对键两端的基团并无严格要求。 R-CO-O-R+H2O RCOOH+ROH2）基团专一性另一些酶，除要求作用于一定的键以外，对键两端的基团还有一定要求，往往是对其中一个基团要求严格，对另一个基团则要求不严格。a-葡萄糖苷酶 a-是糖苷键 糖苷键的一端是葡萄糖底物：蔗糖、麦芽糖 酶专一性类型1 结构专一性 概念：酶对所催化的分子（底物，Substrate）化学结构的

6、特殊要求和选择。 类别：绝对专一性和相对专一性2 立体异构专一性 概念：酶除了对底物分子的化学结构有要求外，对其立体异构也有一定的要求。 类别：旋光异构专一性和几何异构专一性（1）旋光异构专一性：（2）顺反异构专一性： 例如：不同的酶有不同的活性中心，故对底物有严格的特异性。例如乳酸脱氢酶是具有立体异构特异性的酶，它能催化乳酸脱氢生成丙酮酸的可逆反应： A、B、C分别为LDH活性中心的三个功能基团 消化道蛋白酶作用的专一性五、核酶1. 概念：核酶（ribozyme）是具有催化功能的RNA分子，是生物催化剂。核酶又称核酸类酶、酶RNA、 核酶类酶RNA。 它的发现打破了酶是蛋白质的传统观念。2.

7、 反应:大多数核酶通过催化转磷酸酯和磷酸二酯键水解反应参与RNA自身剪切、加工过程。 核酶（ribozyme）4. 作用：随着对核酶的深入研究，已经认识到核酶在遗传病，肿瘤和病毒性疾病上的潜力。比如，对于艾滋病毒HIV的转录信息来源于RNA而非DNA，核酶能够在特定位点切断RNA，使得它失去活性。 核酶的具体作用主要有： 1. 核苷酸转移作用。 2. 水解反应，即磷酸二酯酶作用。 3. 磷酸转移反应，类似磷酸转移酶作用。 4. 脱磷酸作用，即酸性磷酸酶作用。 5. RNA内切反应，即RNA限制性内切酶作用。 核酶（ribozyme）第二节 酶的命名与分类一、酶的命名二、酶的分类一、命名：习惯命

8、名；系统命名（一）习惯命名根据 作用底物（S）：淀粉酶 蛋白酶 反应性质 ：脱氢酶 转氨酶 两者结合 ：乳酸脱氢酶 谷丙转氨酶 来源 ：胃蛋白酶 木瓜蛋白酶（二）系统命名 命名原则 底物1：底物2 反应性质 酶 “L-乳酸：NAD+氧化还原酶”乳酸脱氢酶 国际酶学委员会建议双命名法 系统名+习惯名 根据国际生化协会酶命名委员会的规定，每一个酶都用四个打点隔开的数字编号，编号前冠以EC（酶学委员会缩写），四个数字依次表示该酶应属的大类、亚类、亚亚类及酶的顺序号，这种编码一种酶的四个数字即是酶的标码。例如：EC1.1.1.27（乳酸脱氢酶） 乳酸：NAD氧化还原酶第一大类 氧化还原酶第一亚类 CH

9、OH被氧化第一亚亚类 氢受体为NAD+排序 顺序号为27第三节 酶的作用机理一、 酶的活性中心二、 酶与底物分子的结合三、 影响酶催化效率的因素四、 酶的催化机理一、酶的活性中心1、酶的活性中心 酶分子中直接与底物结合，并和酶催化作用直接有关的区域叫酶的活性中心（Active Center）或活性部位（Active Site），参与构成酶的活性中心和维持酶的特定构象所必需的基团为酶分子的必需基团。实例：胰凝乳蛋白酶（chymotrypsin） 羧肽酶（ribonuclease）也就是只有少数特异氨基酸残基参与底物结合及催化作用。2、催化部位和结合部位酶的活性中心有两个功能部位：一是，与底物结合

10、的结合部位，决定酶对 底物的专一性。二是，催化底物发生键的断裂及新键形成 的催化部位，决定酶促反应的类型， 即酶的催化性质。3、必需基团 一般，酶的分子中存在有许多功能基团例如，-NH2、-COOH、-SH、-OH等，但并不是这些基团都与酶活性有关。出现与酶活性中心并参与催化反应的基团成必需基团。 构成酶活性中心的必需基团可分为两种，与底物结合的必需基团称为结合基团(binding group)，促进底物发生化学变化的基团称为催化基团(catalytic group)。酶的活性中心示意图4、酶活性中心的特点（1）活性中心在酶分子中只占相当小的部分。（2）酶的活性中心具有三维结构。（3）构成酶活

11、性中心的几个氨基酸，它们在一级结构上并不紧密相邻，可能相距甚远，甚至可以在不同的肽链上，但由于酶分子肽链的折叠与卷曲而彼此相互靠近，并形成具有特定结构的区域。AspHisSer胰凝乳蛋白酶的活性中心活性中心重要基团: His57 , Asp102 , Ser195（4）酶的活性中心与底物形状不是正好互补的。（5）酶的活性中心是位于酶分子表面的一个裂缝（Crevice)内。（6）底物通过次级键较弱的作用力与酶分子结合，这些次级键为：氢键、离子键（盐键）、范德华力和疏水相互作用。（7）酶的活性中心具有柔性或可运动性。ZnZn羧肽酶活性中心示意图为Tyr 248 为Arg 145为Glu 270为底

12、物（一）中间产物学说（过渡态学说） 非酶促反应 S P 酶促反应 S+E ES P+E 反应分两步走，活化能大大降低，因此反应容易进行。S+E ES ES EP P+E底物酶中间物过渡态产物酶中间物酶作用的实质在于降低反应活化能二、 酶与底物分子的结合酶催化的中间产物理论E+SP+ EES能量水平反应过程GE1E2 酶（E）与底物（S）结合生成不稳定的中间物（ES），再分解成产物（P）并释放出酶，使反应沿一个低活化能的途径进行，降低反应所需活化能，所以能加快反应速度。几种酶和非酶催化反应的活化能化学反应催化剂活化能/(KJ.mol-1H2O2分解无催化剂75.31胶性铂49.95过氧化酶23.

13、01蔗糖水解氢离子108.08蔗糖酶（酵母）46.02蔗糖酶（麦芽）54.39蛋白水解HCl86.19胰蛋白酶50.21胰凝乳蛋白酶50.21（二）酶与底物的结合 1. 锁钥学说(lock and key theory)：将酶的活性中心比喻作锁孔，底物分子象钥匙，底物能专一性地插入到酶的活性中心。 2. 诱导契合学说(induced-fit hypothesis)：酶的活性中心在结构上具柔性，底物接近活性中心时，可诱导酶蛋白构象发生变化，这样就使使酶活性中心有关基团正确排列和定向，使之与底物成互补形状有机的结合而催化反应进行。1、锁钥学说（1890）： 认为整个酶分子的天然构象是具有刚性结构的

14、，酶表面具有特定的形状。酶与底物的结合如同一把钥匙对一把锁一样。 此学说可以较好的解释酶的立体异构专一性；但不能解释：酶的多底物现象、酶对正反方向的催化等。锁钥学说2、诱导契合学说（1964年 ） 该学说认为酶的活性部位并不是和底物的形状正好互补的，而是在酶和底物结合的过程中，底物分子或酶分子，有时是两者的构象同时发生了一定的变化后才互补的，这时催化基团的位置也正好在所催化底物键的断裂和即将生成键的适当位置。这个动态的辨认过程称为诱导契合。 诱导契合学说 酶与底物靠近 定向 酶与底物相互诱导变形 契合形成中间产物 产物脱离A.靠近定向靠近电性吸引疏水作用定向酶底物 诱导契合机制B.诱导契合活性

15、中心催化基团进行催化诱导互补性结构变化能否契合专一性的由来契合C. 产物脱离酶复原催化剂诱导契合学说三、影响酶催化效果的因素1、邻近效应、 定向效应2、底物分子敏感键扭曲变形3、酸碱催化4、共价催化 5、金属离子催化6、协同催化7、低介电微环境 1、 邻近效应、 定向效应邻近效应：在酶促反应中，由于酶和底物分子之间的亲和性，底物分子有向酶的活性中心靠近的趋势，最终结合到酶的活性中心，使底物在酶活性中心的有效浓度大大增加的效应。定向效应：当专一性底物向酶活性中心靠近时，会诱导酶分子构象发生改变，使酶活性中心的相关基团和底物的反应基团正确定向排列，同时使反应基团之间的分子轨道以正确方向严格定位，使

16、酶促反应易于进行。以上两种效应使酶具有高效率和专一性特点。邻近定向效应2.底物分子敏感键扭曲变形 当酶与底物靠近时，不仅酶构象受底物作用而变化，底物分子也常常受酶作用而变化，也就是酶使底物分子中的敏感键发生“变形”，从而促使底物中的敏感键更易于破裂。因而更容易形成一个互相契合的酶底的复合物而提高催化效率。底物分子发生形变酶底物同时形变产物3、酸碱催化酸碱催化是通过瞬时的定向反应物提供质子或从反应物接受质子以稳定过渡态，加速反应的一类催化机制。 酶分子中可以作为广义酸、碱的基团广义酸基团 （质子供体） 广义碱基团（质子受体） 4、共价催化 催化剂通过与底物形成反应活性很高的共价过渡产物，使反应活

17、化能降低，从而提高反应速度的过程，称为共价催化。它包括两种类型：亲核催化和亲电催化亲核基团： His 的咪唑基，Cys 的硫基，Asp 的羧基，Ser 的羟基等；亲电子基团：H+ 、Mg2+、 Mn2+ 、Fe3+某些辅酶，如焦磷酸硫胺素和磷酸吡哆醛等也可以参与共价催化作用。 5. 金属离子催化 许多酶的催化活性需要金属离子，根据金属离子与酶蛋白相互作用强度可将需要金属的酶分为两类： 一类是金属酶，这类酶中含有紧密结合的金属离子，且大多数是过渡金属离子，如Fe2+, Cu2+, Zn2+, Mn2+等。 另一类是金属-激活酶，这类酶中含有松散结合的金属离子，通常为碱金属离子或者碱土金属离子，如

18、Na+, K+, Ca2+, 或者Mg2+等。1. 金属离子通过可逆地改变其离子的氧化态来调节氧化还原反应，氧化还原反应中包含了金属离子价的变化。许多氧化还原酶含有金属的辅基，电子的转移和金属离子的配基数目、性质有很大的关系。2. 金属离子通过电荷的屏蔽来促进反应的进行。例如：激酶催化的反应真正的底物是ATP-Mg2+复合物而不直接是ATP.3. 金属离子还能通过它的结合水分子的离子化，形成一种有力的亲核体。6. 协同催化 在催化反应中，有时是几个基元催化反应配合在一起协同作用。如胰凝乳蛋白酶通过（组氨酸）His57, （天冬氨酸）Asp102, （丝氨酸）Ser195组成的“电荷转接系统”催

19、化肽键水解，包括亲核催化和碱催化共同作用。AspHisSer胰凝乳蛋白酶的活性中心活性中心重要基团: His57 , Asp102 , Ser1957、低介电微环境的影响（酶活性中心是低介电区域） 酶活性中心处于一个非极性环境中，其介电常数较在水介质（极性介质）中的介电常数低，在非极性环境中两个带电基团之间的静电作用比在极性环境中显著增高。从而有利于同底物的结合。酶催化作用机理：综上所述： 酶与底物结合时，由于酶的变形（诱导契合）或底物变形使二者相互适合，并依靠离子键、氢键、范德华力的作用和水的影响，结合成中间产物，在酶分子的非极性区域内，由于酶与底物的邻近、定向，使二者可以通过亲核亲电催化、

20、一般酸碱催化或金属离子催化方式进行多元催化，从而大大降低反应所需的活化能，使酶促反应迅速进行。第四节 影响酶促反应速度的因素1.底物浓度对酶促反应速度的影响2.酶浓度对酶反应速度的影响3.温度对酶反应速度的影响4.pH对酶促反应速度的影响5.激活剂对酶反应速度的影响6.抑制剂对酶反应速度的影响影响酶促反应速度的因素:*酶促反应动力学（Kinetics of enzyme-catalyzed reactionABC1.底物浓度对酶促反应速度的影响V 表示酶促反应的初始速度，S表示底物浓度，Vmax表示最大反应速度；Km表示米氏常数，1/2Vmax表示最大反应速度的一半。O 在低底物浓度时： 反应

21、速度与底物浓度成正比，表现为一级反应特征。随着底物浓度的增高 反应速度不再成正比例加速；反应为混合级反应。 当底物浓度达到一定值 反应速度达到最大值（Vmax），此时再增加底物浓度，反应速度不再增加，表现为零级反应。米氏方程米氏方程米氏常数E+S ES E+P底物浓度与酶反应速度关系的数学表达式：k1K-1k2K1、k-1、k2为反应速度常数。 S与E形成中间产物，且整个反应速度取决于 ES P+E 产物浓度接近为0（初速度） SE 反应达到平衡 前 提V= VmaxSKm + S米氏常数 ：当v=1/2 Vmax 时的底物浓度 Km=SKm值：是当酶促反应速度达到最大反应速度一半时的底物浓度

22、，它的单位是mol/L或mmol/L,与底物浓度的单位一样。米氏常数KmVK= VmaxS-1()将米氏方程式整理后，可得：关于米氏常数Km的几点意义：Km值是酶的一个重要的特征物理常数,只与酶的性质有关，而与其浓度无关。不同的酶具有不同Km值。 例如：脲酶Km=25mmol/L; 苹果酸酶Km=0.05mmol/Lb. Km值大小可以近似地表示酶与底物结合亲和力的大小， Km愈大，表明达到Vmax的一半时所需底物浓度也大，这意味着酶与底物亲和力弱；反之，Km小，则表明酶与底物的亲和力强。 c. 如果一种酶可以催化几种底物发生反应，就必然对每一种底物，各有一个特定的Km值。其中，Km最小的底物

23、是该酶的最适底物。d. 如果已知某个酶的Km值，可由所要求的反应速度（反应到Vmax的百分数），求出应当加入底物的合理浓度；反过来，也可以根据已知的底物浓度，求出该条件下可以达到的反应浓度。e. Km可以帮助推测某一个代谢反应的方向和途径。例如：谷氨酸脱氢酶:NAD+的Km值为1.810-5 mol/L, NADH的Km值为2.510-5mol/L。 因为依据Km大小，应该是NAD+ 为谷氨酸脱氢酶的最适底物，该酶催化的逆反速度要占优势。+NH3+H2O谷氨酸脱氢酶 米氏常数的测定： 基本原则：将米氏方程变化成相当于y=ax+b的直线方程，再用作图法求出Km。 例：双倒数作图法（Linewea

24、ver-Burk法） 米氏方程的双倒数形式： 1 Km 1 1 = . + v Vmax S Vmax 酶动力学的双倒数图线2. 酶浓度对酶反应速度的影响 在一定条件下酶促反应的速度与酶的浓度成正比。 当底物浓度大大超过酶浓度时，反应达到最大速度。如果此时增加酶的浓度可增加反应速度，酶促反应的速度与酶的浓度成正比关系。3. 温度对酶反应速度的影响温度对酶促反应速度的影响：a.一方面是温度升高,酶促反应速度加快(温度系数Q10：反应温度提高10 C，其反应速度与原来的反应速度之比。 Q10多为1-2 ) 。b.另一方面,温度升高,酶的高级结构将发生变化或变性，导致酶活性降低甚至丧失，反应速度很快

25、下降。使酶促反应速度达最大时的温度称为酶的最适温度。最适温度4. pH对酶促反应速度的影响pH值影响酶活力的原因有以下几点：影响酶分子构象的稳定性。影响酶分子（包括辅因子）极性基团的解离状态，使其荷电性发生变化c. 影响底物分子的解离状态d. 过酸过碱导致酶蛋白变性酶反应速度最大时的溶液pH，称为酶的最适pH5. 激活剂对酶反应速度的影响 凡能提高酶活性的物质，都称为激活剂（Activator） 类别 金属离子：K+、Na+、 Mg2+、Cu2+、Mn2+、Zn2+、Se3+ 、 Co2+、Fe2+ 阴离子： Cl-、Br- 有机分子 还原剂：抗坏血酸、半胱氨酸、谷胱甘肽 金属螯合剂：EDTA

26、 （1）抑制作用与抑制剂 （2）抑制作用的类型 （3）可逆抑制作用的动力学特征 （4）一些重要的抑制剂6. 抑制剂对酶反应速度的影响 凡使酶的活性降低或丧失，但并不引起酶蛋白变性的作用称为抑制作用。主要是由于酶的必需基团化学性质的改变而引起的。 （抑制作用不同于失活作用） 能够引起抑制作用的化合物则称为抑制剂。 （抑制剂不同于变性剂）（1）抑制作用与抑制剂a.不可逆抑制作用 b.可逆抑制作用 竞争性抑制非竞争性抑制反竞争性抑制专一性不可逆抑制作用非专一性不可逆抑制作用(2) 抑制作用的类型定义：抑制剂与酶的活性中心的功能基团共价结合而抑制酶的活性,不能用透析或超滤等物理方法除去抑制剂而恢复酶活

27、性。专一性不可逆抑制作用：这类抑制剂只作用于与酶活性部位有关的氨基酸残基或一类酶。非专一性不可逆抑制作用：这类抑制剂作用于酶分子上一类或几类不同的基团或作用于几类不同的酶。 如：酰化剂酸酐和磺酰氯等可使酶蛋白的-OH、SH、NH2等发生酰化而使酶失活。不可逆抑制作用（修饰抑制） 抑制剂与酶蛋白以非共价方式结合，引起酶活性暂时性丧失。抑制剂可以通过透析等物理方法被除去，并且能部分或全部恢复酶的活性。 根椐抑制剂与酶结合的情况，又可以分为三类b1 竟争性抑制b2 非竟争性抑制b3 反竞争性抑制b. 可逆抑制作用b.可逆抑制作用 b1竟争性抑制 竟争性抑制通常可以通过增大底物浓度，即提高底物的竞争能

28、力来消除。S无活性中间产物 某些抑制剂的化学结构与底物相似，因而能与底物竟争与酶活性中心结合。当抑制剂与活性中心结合后，底物被排斥在反应中心之外，其结果是酶促反应被抑制了。例：丙二酸和戊二酸对琥珀酸脱氢酶结合但不能催化脱氢竞争性可逆抑制图示Ib2 非竟争性抑制 酶可同时与底物及抑制剂结合，即底物和抑制剂没有竞争作用。酶与抑制剂结合后，还可与底物结合；酶与底物结合后，也可再结合抑制剂，但是三元的中间产物不能进一步分解为产物，所以酶活性降低。 非竞争性抑制剂与酶活性中心以外的基团结合。这类抑制作用不会因提高底物浓度而减弱。无活性中间产物非竞争性可逆抑制图示非竞争竞争性抑制作用非竞争性抑制作用竞争性

29、非竞争性抑制作用机理示意图底物与酶专一性结合b3 反竞争性抑制 酶只有与底物结合后才与抑制剂结合，形成的三元中间产物不能进一步分解为产物，所以酶活性降低。这类抑制作用最不重要。 反竞争性抑制作用常见于多底物反应中，而在单底物反应中比较少见。无活性中间产物竞争性抑制曲线非竞争性抑制曲线反竞争性抑制曲线有无抑制剂存在时酶促反应的动力学方程可逆抑制的动力学比较抑制类型 Vmax Km无抑制剂 Vmax Km竞争性抑制 不变 变大非竞争性抑制 变小 不变 反竞争性抑制 变小 变小 （4）一些重要的抑制剂 a.不可逆抑制剂 1.有机磷化合物与酶活性直接有关的丝氨酸上的-OH牢固地结合，从而抑制某些蛋白酶

30、或酯酶。（敌百虫、敌敌畏、农药1605等） 2.有机汞、有机砷化合物与酶蛋白上的-SH作用，从而抑制含-SH酶的活性。 （对氯汞苯甲酸）3.氰化物、硫化物和CO这类物质能与酶中的金属离子形成较为稳定的络合物，使酶的活性受到抑制。4.重金属Ag、Cu、Hg等盐能使大多数酶失活，加入EDTA可以除去。5.烷化剂这一类试剂中往往含一个活泼的卤素原子，如碘乙酸、碘乙酰胺和2，4-二硝基氟苯等，使酶蛋白中的 SH、-NH2、-OH等发生烷基化， 失活。6.青霉素抗菌素类药物，与糖肽转肽酶活性部位Ser-OH共价结合，使酶失活。 “自杀性底物” b. 可逆抑制剂 在可逆抑制剂中最重要的是竞争性抑制剂。 如

31、：磺胺药、氨基叶酸等。用增加底物浓度的方法可以减弱抑制作用。 非专一性不可逆抑制剂 抑制剂作用于酶分子中的一类或几类基团，这些基团中包含了必需基团，因而引起酶失活。类型：专一性不可逆抑制剂 这类抑制剂选择性很强，它只能专一性地与酶活性中心的某些基团不可逆结合，引起酶的活性丧失。 实例：有机磷杀虫剂-Ser-OH-Ser-OPO-RO-ROPO-RO-ROX第五节 几种重要的调节酶一、别构酶概念：酶分子的非催化部位与某些化合物可逆地非共价结合后导致酶分子发生构象改变，进而改变酶的活性状态，称为酶的别构调节(Allosteric Regulation)，具有这种调节作用的酶称别构酶(Alloste

32、ric Enzyme)。别构酶促反应底物浓度和反应速度的关系不符合米氏方程，呈S型曲线。 凡能使酶分子发生别构作用的物质称为效应物(Effector)，通常为小分子代谢物或辅因子。如因别构导致酶活性增加的物质称为正效应物(Positive Effector)或别构激活剂，反之称负效应物(Negative Effector)或别构抑制剂。 别构调节普遍存在于生物界，许多代谢途径的关键酶利用别构调节来控制代谢途径之间的平衡，研究别构调控有重要的生物学意义。实例：天冬氨酸转氨甲酰酶 （Anspartate Transcarbamoylase，ATCase）别构酶活性调节机理：序变模型和齐变模型酶的别

33、构（变构）效应示意图效应剂别构中心活性中心别构酶的反馈调控机理A （产物或中间产物）EDCB关键酶 a-非调节酶b-正协同别构酶的S形曲线 别构酶与米氏酶的动力学曲线比较1-非调节酶2-正协同别构酶3-负协同别构酶 正、负协同别构酶与非调节酶的动力学曲线比较别构酶的序变模型RRRRRRRRRRRRRR亚基全部处于R型亚基全部处于T型依次序变化别构酶的齐变模型RRRRRRRRRRT状态（对称亚基）T状态（对称亚基）RRRR对称亚基对称亚基齐步变化二、同工酶 概念：存在于同一种属或不同种属，同一个体的不同组织或同一组织、同一细胞，具有不同分子形式但却能催化相同的化学反应的一组酶，称之为同工酶（is

34、oenzyme）。乳酸脱氢酶是研究的最多的同工酶。 生物学功能：遗传的标志 和个体发育及组织分化密切相关 适应不同组织或不同细胞器在代谢上的不同需要 在各学科中的应用同工酶大鼠各组织LDH同工酶电泳图谱同工酶的基因先转录成同工酶的信使核糖核酸（mRNA)，后者再转译产生组成同工酶的肽链，不同的肽链可以不聚合的单体形式存在，也可聚合成纯聚体或杂交体，从而形成同一种酶的不同结构形式。 数百种同工酶，研究最多的是人和动物体内的乳酸脱氢酶（LDH)。乳酸脱氢酶同工酶形成示意图多肽亚基mRNA四聚体结构基因a b乳酸脱氢酶同工酶电泳图谱+H4MH3M2H2M3HM4点样线不同组织中LDH同工酶的电泳图谱

35、LDH1(H4)LDH2(H3M)LDH3(H2M2)LDH4(HM3)LDH5(M4)心肌 肾 肝 骨骼肌 血清-+原点人体心、肝和骨骼肌LDH同工酶谱组织器官 LDH1 LDH2 LDH3 LDH4 LDH5 （ 占总 LDH活性的百分比） 心 3570 2845 216 06 05 肝 08 210 333 627 308 骨骼肌 110 418 838 936 4097正常血清 27.12.8 34.7 4.3 20.9 2.4 11.7 3.3 57 2.9 用电泳方法将LDH同工酶分离，分析其酶谱，发现脊椎动物各组织中有五条酶带。每条酶带的酶蛋白都是由四条肽链组成的四聚体，LDH有

36、两类肽链，A（M）或B（H），各有不同的免疫性质，按排列组合可形成符合于电泳酶带数的五种同工酶。LDH1及LDH5分别由纯粹的4条B链（B4）和4条A链（A4）形成，称为纯聚体；而LDH2、LDH3和LDH4都是由两类肽链杂交而成的，分别可写成AB3、A2B2、A3B，称为杂交体。 同工酶在各学科中的应用 (1) 遗传学和分类学：提供了一种精良的判别遗传标志的工具。(2) 发育学：有效地标志细胞类型及细胞在不同条件下的分化情况，以及个体发育和系统发育的关系。(3) 生物化学和生理学：根据不同器官组织中同工酶的动力学、底物专一性、辅助因子专一性、酶的变构性等性质的差异，从而解释它们代谢功能的差别

37、。（4）医学和临床诊断：体内同工酶的变化，可看作机体组织损伤，或遗传缺陷，或肿瘤分化的的分子标志。在生物学中，同工酶可用于研究物种进化、遗传变异、杂交育种和个体发育、组织分化等。例如： 最原始的脊椎动物七鳃鳗（Lamprey）只有一种LDH肽链，进化到较高级的鱼类才有A、B两类肽链； 通过对地理分布不同的物种间某一同工酶谱的普查可以推测物种的地理来源； 动、植物的遗传变异可通过子代和亲代同工酶谱的比较来鉴别； 法医学中也可用多种同工酶谱的分析来鉴定亲子关系。 细胞杂交或植物杂交育种后是否出现新品种也可用周工酶谱的比较来确定； 在个体发育中，从胚胎到出生，再到成年，随着组织的分化和发育，各种同工

38、酶谱也有一个分化转变的过程。 三、酶的共价修饰 某些酶可以通过其它酶对其多肽链上某些基团进行可逆的共价修饰，使其处于活性与非活性的互变状态，从而调节酶活性。这类酶称为共价修饰酶。目前发现有数百种酶被翻译后都要进行共价修饰，其中一部分处于分支代谢途径，成为对代谢流量起调节作用的关键酶或限速酶。 由于这种调节的生理意义广泛，反应灵敏，节约能量，机制多样，在体内显得十分灵活，加之它们常受激素甚至神经的指令，导致级联放大反应，所以日益引人注目。 AP1GEDCBHEa-bEc-dEc-g关键酶（限速酶）P2蛋白质的磷酸化和脱磷酸化 蛋白激酶ATPADP蛋白质蛋白质Pn蛋白磷酸酶nPiH2O第一类：Se

39、r/Thr型第二类：Tyr型 第一类：Ser/Thr型 第二类：Tyr型 第三类：双重底物型共价修饰反应的例子磷酸化腺苷酰化尿苷酰化Tyr,Ser,Thr.HisTyrTyr甲基化GluS-腺苷-MetS-腺苷-同型 Cys反应类型 共价修饰 被修饰的氨基酸残基 级联系统调控糖原分解示意图意义：由于酶的共价修饰反应是酶促反应，只要有少量信号分子（如激素）存在，即可通过加速这种酶促反应，而使大量的另一种酶发生化学修饰，从而获得放大效应。这种调节方式快速、效率极高。肾上腺素或胰高血糖素1、腺苷酸环化酶（无活性）腺苷酸环化酶（活性）2、ATPcAMPR、cAMP3、蛋白激酶（无活性）蛋白激酶（活性）

40、4、磷酸化酶激酶（无活性）磷酸化酶激酶（活性）5、磷酸化酶 b（无活性）磷酸化酶 a（活性）6、糖原6-磷酸葡萄糖1-磷酸葡萄糖葡萄糖血液ATP ADPATP ADP肾上腺素或胰高血糖素132102104106108葡萄糖456（极微量）（大量） 四、酶 原 体内合成出来的酶，有时不具有生物活性，经过蛋白水解酶专一作用后，构象发生变化，形成活性中心，变成有活性的酶。这个不具活性的蛋白质称为酶原（zymogen或proenzyme），这个过程称为酶原的激活。 该变化过程，是生物体的一种调控机制 。这种调控作用的特点是，蛋白质由 无活性状态转变成活性状态是不可逆的。实例：消化系统蛋白酶原的激活 凝

41、血机制（自学）胰蛋白酶原胰蛋白酶六肽肠激酶活性中心胰蛋白酶原的激活示意图胰蛋白酶原胰蛋白酶六肽肠激酶胰蛋白酶对各种胰脏蛋白酶的激活作用胰凝乳蛋白酶原胰凝乳蛋白酶弹性蛋白酶原弹性蛋白酶羧肽酶原羧肽酶酶原和酶原的激活 酶原(zymogen)：酶的无活性的前体 酶原的激活：由无活性的酶原转变为有活性的酶的过程。 酶原激活的意义：在特定的环境和条件下发挥作用；避免细胞自身消化；有的酶原可以视为酶的储存形式。酶原激活的机理:酶 原分子构象发生改变形成或暴露出酶的活性中心 一个或几个特定的肽键断裂，水解掉一个或几个短肽在特定条件下赖缬天天天天甘异赖缬天天天天缬组丝SSSS46183甘异缬组丝SSSS肠激酶

42、胰蛋白酶活性中心胰蛋白酶原的激活过程胰蛋白酶原胰蛋白酶六肽+弹性蛋白酶原弹性蛋白酶 + 碎片胰凝乳蛋白酶原-胰凝乳蛋白酶 +二肽羧基肽酶原A羧基肽酶A + 碎片肠激酶自身催化肠激酶启动的酶原激活第六节 酶的分离提纯与酶活力测定一、酶分离提纯的一般原则二、酶活力的测定一、酶分离提纯的一般原则1）判断分离提纯酶的方法好坏，两个指标：一是, 酶的总活力回收；二是, 酶的比活力提高的倍数。2) 目标：增加酶的产量、提高酶的纯度、保持酶的生物活性。3) 原则： 一是，选择一种酶含量丰富的新鲜生物 材料。 二是，设法去除杂质蛋白质和其他大分子物质。酶分离提纯的一般步骤主要包括：1. 样品的前处理：以高速组

43、织捣碎机、均浆机、研钵等进行机械破碎法；在低渗条件下使细胞溶胀而破碎的渗透破碎法；细胞内液结冰膨胀而使细胞胀破的反复冻融法；超声波振荡器法用溶菌酶破坏微生物细胞等的酶法。2. 粗分级分离：得到的组织均浆以水或低离子强度的缓冲液提取，获得酶的粗提液。3.细分级分离：根据溶解度差别：等点沉淀等根据分子大小：透析、超过滤等根据所带电荷：电泳等。利用吸附特性：疏水作用层析等利用配给配体特异结合：亲和层析。二、酶活力的测定（一）酶活力测定的条件酶活力 检测酶含量及存在，很难直接用酶的“量”（质量、体积、浓度）来表示，而常用酶催化某一特定反应的能力来表示酶量，即用酶的活力表示。 酶催化一定化学反应的能力称

44、酶活力，酶活力通常以最适条件下酶所催化的化学反应的速度来确定。即：最适温度、最适PH和最适缓冲液离子强度等最佳条件下。活力单位（active unit） 习惯单位（U）: 底物(或产物)变化量 / 单位时间 国际单位（IU）: 1moL变化量 / 分钟 Katal（Kat）：1moL变化量 / 秒比活力=总活力单位总蛋白mg数= U(或IU) mg蛋白量度酶催化能力大小转换系数（Kcat） 底物（ moL）/ 秒每个酶分子量度酶纯度比活力（specific activity）量度转换效率 （二） 酶活力的表示方法三、 酶活力测定方法 终点法: 酶反应进行到一定时间后终止其反应，再用化学或物理方

45、法测定产物或反应物量的变化。 动力学法:连续测定反应过程中产物底物或辅酶的变化量，直接测定出酶反应的初速度。第七节 酶工程与酶的应用酶工程的概念: 酶工程：是指酶制剂在工业上的大规模生产及应用。1971年第一届国际酶工程会议上得到命名。主要研究：酶的生产、纯化、固定化技术、酶分子结构的修饰和改造及其在工、农、医药等领域的应用。天然酶在开发和应用方面受到限制： 1.酶的不稳定性 2.酶的分离、纯化较难，成本高，价格贵。一、酶工程的概念及研究内容 1. 化学方法：通过对酶的化学修饰或固定化处理，改善酶的性质以提高酶的效率和降低成本，或通过化学合成法制造人工酶。 2. 利用基因重组技术生产酶以及对酶

46、基因进行修饰或设计新基因，生产出性能稳定、具有新的生物活性以及催化效率更高的酶。目前在酶的应用方面所采取的一般方法：一、化学酶工程 天然酶 固定化酶 化学修饰酶 人工模拟酶二、生物酶工程 克隆酶 突变酶 新酶 将酶学和工程学相结合，产生了酶工程(enzyme engineering)这样一个新的领域。酶工程主要研究酶的生产、纯化、固定化技术、酶分子结构的修饰和改造以及在工农业、医药卫生和理论研究等方面的应用。（一）、化学酶工程 化学酶工程亦称初级酶工程： 指天然酶、化学修饰酶、固定化酶及人工模拟酶的研究和应用。 1.天然酶 主要指工业用酶，从微生物发酵得到的酶。如：洗涤剂、皮革生产中用的蛋白酶；纸张制造用的淀粉酶；乳制品用的凝乳酶等。 2.化学修饰酶：用于医药及研究工作，通过（1）化学修饰酶的功能基 ；（2）通过交联反应；（3）大分子修饰作用。 3.固定化酶：将水溶性酶用物理或化学方法，使之成为不溶于水的，但仍具有酶活性的状态。 4.人工模拟酶化学法合成酶（已知酶的活性中心和作用机理）。（二）、生物酶工程 生物酶工程的主要内容： 克隆酶用基因工程技术大量生产酶（ -淀粉酶，青霉