半枝莲通过线粒体通路诱导小鼠肝癌细胞凋亡课件

1、半枝莲提取物通过与caspase-3有关的线粒体通路诱导肝癌细胞H22细胞凋亡 半枝莲是一种多年生草本植物，在中药中也被称为半枝莲。主要分布在华南地区，已被用作中国和韩国的肺癌，消化系统癌症，肝癌，乳腺癌和绒毛膜上皮瘤的抗肿瘤剂以及抗炎药和利尿剂。来自半枝莲的提取物(ESB)在体外对许多人类癌症（包括白血病，结肠癌，肝癌和皮肤癌）的生长有抑制作用。然而，其抗肿瘤机制仍不清楚。据报道，许多中草药具有抗癌特性，可以诱导细胞凋亡凋亡。现已经解决的三种凋亡途径，包括线粒体途径，死亡受体途径和内质网应激介导的细胞凋亡途径。 在大多数生理和病理情况下，线粒体通路启动细胞凋亡。吴茱萸中二氢吴茱萸新碱的定量分

2、析 背景在线粒体启动的途径中，经历渗透性转换的线粒体将线粒体膜间隔的细胞色素C或细胞凋亡诱导因子的细胞凋亡蛋白释放到细胞溶质中。释放的细胞色素C可以激活caspase-9，并且激活的caspase-9反过来切割并激活子caspase-3。caspase-3激活后，caspase-3的某些特异性底物如聚（ADP-核糖）和聚合酶（PARP）被切割，最终导致细胞凋亡。吴茱萸中二氢吴茱萸新碱的定量分析1.实验目的：研究半枝莲对肝癌细胞的生长抑制作用和它对肝癌细胞凋亡的影响确定半枝莲抑制小鼠肝癌细胞H22活性的机制。吴茱萸中二氢吴茱萸新碱的定量分析2.实验材料与试剂 吴茱萸中二氢吴茱萸新碱的定量分析新鲜

3、牛血清，RPMI-1640培养基，碘化丙啶（PI），二甲基亚砜（DMSO），核糖核酸酶（RNaseA），罗丹明123（Rh123） ，3-（4,5-二甲基噻唑-2-基）-2,5-二苯基四唑溴化物（MTT），抗caspase-3和细胞色素C的小鼠单克隆抗体。凋亡细胞Hoechst 33258检测试剂盒，荧光探针罗丹明123。体重220-250g的雄性SD大鼠。3.实验方法与结论，补吴茱萸中二氢吴茱萸新碱的定量分析MTT法检测H22细胞增殖情况方法：将H22细胞在96孔板中以5103个细胞/孔的浓度接种，并在37下生长直到粘附。处理后，加入50g/10L的MTT，将细胞再孵育4小时。 除去上清液后

4、，向每个孔中加入200LDMSO。 振荡板10分钟后，使用酶标仪（EX-800型）测定90nm波长处的吸光度，检测细胞活力。 细胞活力（）=实验吸光度组/空白对照组吸光度100。H22细胞用不同剂量的ESB处理，分别在0,24,48,72和96 h后评价H22细胞的生长速度。不同ESB治疗组H22细胞的细胞活力显着高于5-FU治疗组（图1），高剂量ESB明显抑制H22细胞增殖（P 0.05）。MTT测定显示高剂量和中等剂量的ESB以时间依赖的方式在体外抑制H22细胞的增殖。吴茱萸中二氢吴茱萸新碱的定量分析高分辨率透射电子显微镜显示正常的H22细胞是圆形和规则的，在少数肿瘤细胞中具有染色质边缘（

5、图2A）。在高ESB剂量治疗48小时后，部分核膜以尖锐的角度向外突出。H22细胞典型的凋亡形态出现如，在高ESB剂量组（图2B-D）中可以观察到细胞核的色素凝集和碎裂，软骨细胞肿胀，凋亡体形成。A：正常肝细胞H22细胞 B：高ESB剂量组的核染色和色素凝集; C：高ESB剂量组凋亡小体 D：高ESB剂量组的软骨细胞肿胀 A：对照组 B：低剂量治疗组 C：中剂量治疗组; D：高剂量治疗组用不同剂量的ESB治疗48h后，用Hoechst 33258染色H22细胞在荧光显微镜下观察。凋亡细胞的染色质比正常细胞更亮。凋亡的特征，如核收缩，DNA缩合和分裂，在ESB治疗组中发现（图3B-D）。对照组、低

6、ESB剂量组、高ESB剂量组凋亡细胞百分比分别为3.362.14，14.574.28，43.155.33，72.656.52。此外，凋亡细胞的数量以剂量依赖的方式逐渐增加。细胞周期分析H22细胞以5105个细胞/孔在6孔板中孵育，用同源药物处理48小时。 收集分离和附着的细胞，并在70冰冷的乙醇中于-20固定过夜。固定后，用PBS洗涤细胞，重悬于含有1mg / mL核糖核酸酶和50g/ mL PI的1mL PBS中，并在37下在黑暗中孵育30分钟。将10 000个细胞上流式细胞仪分析DNA含量，并用CellQuest获取软件分析细胞周期相分布。3.实验方法与结论ESB对线粒体膜电位的影响在激光

7、扫描共聚焦显微镜（LSCM）下用罗丹明123（Rh123）染色检测线粒体跨膜电位（m）。通过胰蛋白酶消化收集约1106个细胞，用PBS洗涤2次，并在最终浓度为1L/ mL的Rh123中于37暗处孵育20分钟，以1000r / min离心5分钟，用培养基洗涤两次，重悬于培养基中，37培养在含有CO2的培养箱中培养60分钟。在激光扫描共焦显微镜488nm的激发波长，530nm的发射波长下测定荧光强度。细胞中罗丹明123的荧光强度代表线粒体膜电位。3.实验方法与结论A：对照组 B：低ESB剂量组; C：中ESB剂量组; D：高ESB剂量组。 荧光强度（FI）表明细胞中线粒体的膜电位线粒体在凋亡中起重

8、要作用。 为评估ESB是否影响线粒体功能，采用激光扫描共聚焦显微镜检测线粒体膜电位，Rh123染色。空白对照组H22细胞中罗丹明123荧光强度最强（图4）。用不同剂量的ESB治疗48h后，方差分析显示荧光强度以剂量依赖性方式降低（P 0.05）线粒体膜电位的降低可能促进细胞色素C的释放，在用小鼠单克隆细胞色素C抗体的Western印迹分析中，用不同剂量的ESB处理的H22细胞中测量细胞质中细胞色素C的蛋白质水平。ESB处理后细胞溶质中细胞色素C的含量以剂量依赖性方式显着增加（P 0.05）Western印迹分析显示低ESB剂量组caspase-3蛋白水平逐渐升高（P 0.05），说明caspase-3可以通过ESB激活。测定caspase-3活性使用caspase-3活性测定试剂盒测定caspase-3活性。具体操作通过检测标准样品的吸光度来绘制标准曲线，在室温下孵育1小时后，收集H22细胞并在半胱天冬酶测定缓冲液中完全裂解。在波长为405nm下使用平板读数光度计测量caspase-3的活性。3.实验方法与结论 A：控制组; B：低ESB剂量组; C：中ESB剂量组; D：高ESB剂量组。ES