雌黄(三硫化二砷)诱导HL60细胞凋亡与坏死的实验研究

1、雌黄(三硫化二砷)诱导HL-60细胞凋亡与坏死的实验研究【摘要】目的研究雌黄As2S3能否诱导急性粒细胞白血病细胞株HL-60凋亡与坏死。方法以不同浓度的As2S3在不同的时间处理体外培养的HL-60细胞株，应用细胞生长测定、形态学观察及流式细胞仪检测等多种方法，在体外研究As2S3对HL-60细胞凋亡和增殖抑制的作用。通过对细胞进展AnnexinV和碘化丙锭PI双重染色，应用流式细胞仪可以区分活细胞、凋亡细胞与坏死细胞。结果2.5l/LAs2S3作用18h后诱导HL-60小局部细胞凋亡和大局部细胞坏死，7.5l/LAs2S3作用8h后可引起HL-60细胞凋亡。结论As2S3可诱导HL-60细

2、胞凋亡与坏死，有必要进一步探究其对急性粒细胞白血病治疗的价值。【关键词】雌黄(三硫化二砷)；HL-60细胞；凋亡ExperientalstudynAs2S3(rpient)induedapptsisandnersisfhuanleukeiaelllineHL-60【Abstrat】bjetiveTheurrentstudyasdesignedtinvestigatehetherAs2S3(rpient)illindueapptsisandnersisfhuanauteylidleukeiaelllineHL-60.ethdsAuteleukeiaelllineHL-60asusedasinvi

3、trdel.HL-60elllineastreatedithAs2S3atdifferentnentratinsanddifferentperid，andellgrthasanalyzedithtrypanblueexlusin.Apptsisasassessedithellrphlgyinludingirspeandeletrnirspeandflytetry，thelatterandistinguishliveell，appttiellandnertiellthrughdublestainingfAnnexinVandprpidiuidide，fhihfluresentintensitie

4、sereeasurednflytetry.Results2.5l/LfAs2S3uldinduestfellHL-60nersisandasallpartfellapptsisithin18h，7.5l/LAs2S3uldindueapptsisfhuanleukeiaelllineHL-60ithin8hurs.nlusinItisneessarytstudyfurtherthetherapeutivaluefAs2S3nauteylidleukeia.SineitanindueapptsisandnersisfHL-60ell.【Keyrds】As2S3(rpient)；HL-60ell；

5、Apptsis近年来对急性早幼粒细胞白血病APL的治疗方面的有关研究获得了重大进展，全反式维甲酸、三氧化二砷以及复方青黛片主要成分为As4S4对APL治疗均有较高完全缓解率，尤其后两者对APL治疗作用，主要是通过凋亡来实现的1，因此诱发细胞凋亡已成为白血病治疗的新思路。本研究旨在进一步探究中药雌黄(又称黄砷，主要成分为As2S3)在体外对急性粒细胞性白血病细胞株HL-60的凋亡与坏死作用。1材料与方法1.1制剂As2S3上海化学试剂公司配成500l/L的储存液，过滤灭菌，4存放备用，临用前稀释成所需浓度。1.2细胞培养及细胞生长状况测定HL-60细胞由江苏省血液研究所陈子兴教授惠赠细胞以210

6、5/l接种于RPI1640培养液10%胎牛血清，100U/l青霉素和100g/l链霉素中培养37、5%2。加药后逐日取药物处理组与对照组细胞台盼蓝染色，光镜下计数活细胞总数连续6天，绘制生长曲线。1.2.1细胞形态观察及流式细胞仪测定培养细胞经3.0l/LAs2S3孵育一定时间后搜集2106细胞PBS洗2遍，1500r/in离心5in，弃上清，42%戊二醛固定72h后，1%锇酸固定，梯度脱水，EPN-812包埋，超薄切片，铀和铅双重染色后透射电镜下观察。Annexin-V标记按Iun-teh公司的说明书进展，1106细胞用冰PBS洗2次，调整细胞浓度为1106/l，加5lAnnexinV1：1

7、0稀释和5l碘化丙锭PI250g/l于490l细胞悬液中，放置冰浴10in，用流式细胞仪(型号ULTEREPIS-XL)分析细胞凋亡情况。1.2.2杀伤力检测以TT四甲偶氮唑蓝比色法检测As2S3对HL-60细胞的杀伤率。将生长良好的HL-60细胞以2105/l浓度参加96孔培养板，每孔100l，参加不同浓度的As2S3，每一浓度设3个复孔，并设对照孔，置37、5%2条件下培养48h，参加TT5g/l10l/孔，继续孵育2h后，再参加DS100l/孔，打匀后酶标仪型号irReaderT4Plus570n处读吸光度A值。并利用对数几率图解法测定药物的半数抑制浓度I50。2结果2.1As2S3对H

8、L-60细胞增壮的抑制作用经0.5l/LAs2S3处理的HL-60细胞生长受到细微抑制，经1l/L、2l/LAs2S3处理的HL-60细胞生长受到明显抑制见图1，As2S3处理48h，对HL-60细胞的I50为1.23l/L。2.2形态学变化HL-60细胞经As2S3处理后，在透射电镜下可见典型的凋亡形态学特征：细胞固缩，胞浆浓缩，染色质聚集，核碎裂，有的形成凋亡小体见图，亦可见到坏死细胞(见图3)。在倒置显微镜下可见凋亡细胞体积缩小，胞膜完好，细胞折光度明显加深，坏死细胞膜破裂，活细胞那么细胞透亮、折光度好。图1As2S3对HL-60细胞的增殖抑制作用图2HL-60凋亡细胞超微构造(8000

9、)图3HL-60坏死细胞超微构造(8000)2.3流式细胞仪结果由于本实验采用了法国Iun-teh公司试剂盒对细胞进展AnnexinV与PI双重染色，故可以对活细胞、凋亡细胞与坏死细胞进展区分。As2S3浓度分别为2.5l/L、5.0l/L、7.5l/L与HL-60细胞培养18h，HL-60细胞凋亡率分别为3.24%、3.5%、5.75%，细胞坏死率分别为62.9%、76.9%、88.7%，其空白阴性对照组凋亡率与坏死率分别为1.53%、0.91%；As2S3浓度分别为2.5l/L、5.0l/L、7.5l/L、10.0l/L、15.0l/L与HL-60细胞培养8h，HL-60细胞凋亡率分别为3

10、.41%、6.03%、15.0%、27.1%、35.5%，细胞坏死率分别为1.81%、2.81%、4.47%、16.5%、16.4%；其空白阴性对照组凋亡率与坏死率分别为1.1%、0.75%。3讨论细胞凋亡是当前肿瘤研究中的热点之一，恶性肿瘤细胞凋亡受阻是恶性肿瘤的重要成因之一。目前有学者提出了促进细胞凋亡是治疗肿瘤的新途径，并已经发现很多因素可以不同程度地诱发肿瘤细胞的凋亡，有的由于对肿瘤细胞诱导凋亡程度较低而不满意，因此选择凋亡诱导率高的药物显得极为重要。砷剂长期以来被认为是一种致癌物质，可致细胞内某些重要酶失活、干扰细胞代谢，使染色体畸变等2。上海血研所对As23治疗APL作了深化研究，

11、并认为是诱发APL细胞凋亡，下调APL细胞bl-2表达，降解PL-RAR蛋白3，其PL-RAR蛋白可能是抑制细胞凋亡的癌蛋白3。郝红缨、刘辉等4，5均证实砷剂对急性早幼粒细胞白血病细胞有诱导凋亡的作用。近年来，我国学者6，7率先在世界上分别报道了As23与复方青黛片(主要成分As4S4)治疗急性早幼粒细胞白血病(APL)的疗效，其中前者治疗APL，完全缓解率达65.6%，后者完全缓解率达98.3%，两者均是通过砷剂而实现，两者对APL的疗效不一样，其中As4S4疗效明显好于As23，但目前这两种砷剂均仅对APL有较好疗效，对其他类型白血病根本无效，据此有必要进一步探究其他砷剂等物质对白血病及其

12、他肿瘤的根底与临床研究。在细胞凋亡实验中，流式细胞仪在细胞凋亡研究中是具有准确客观的判断指标，而电镜指标更直观、最可靠，我们用流式细胞仪观察7.5l/LAs2S3作用HL-60细胞8h即有15.0%细胞凋亡，而同时行TT时结果那么几乎没有抑制作用。细胞凋亡早期位于细胞膜内侧的磷脂酰丝氨酸PS迁移到细胞外侧，因此可以利用对PS有高度亲和力的磷脂结合蛋白AnnexinV检测细胞凋亡，在凋亡早期即可发现细胞凋亡。但坏死细胞PS亦暴露于外表使AnnexinV结合阳性，因此仅使用AnnexinV这一参数不能区分坏死与凋亡细胞，必须同时采用PI这一参数将坏死细胞与凋亡细胞区分开来。凋亡细胞PI低染，坏死细

13、胞高染，在流式细胞仪图上表现为活细胞AnnexinVPI，凋亡细胞AnnexinV+PI，坏死细胞AnnexinV+PI+，本方法可区分凋亡、坏死及活细胞各组分8，故其指标较敏感。随着作用时间延长细胞凋亡比例下降而细胞坏死比例却大幅增加，故推测细胞坏死是凋亡细胞的继发性坏死所致。细胞生长曲线图示As2S3对HL-60细胞具有增殖抑制作用，其抑制作用主要是通过细胞凋亡与坏死来实现的，为其进一步用于临床提供了理论根据和实验模型，但其详细机理是否与陈国强等2报道一样以及它是否具有一定的临床价值有待进一步深化研究。【参考文献】1陆道培，王勤，刘延芳，等.中国急性早幼粒细胞白血病的治疗进展.北京大学学报

14、医学片版，2002，34：427-430.2DngJT，LuX.EffetsfarseninDNAdaageandrepairinhuanfetallungfibrblasts.utatRes，1994，315：11-15.3henGQ，ZhuJ，ShiXG，etal.Invitrstudiesnellularandleularehanissfarsenitrixide(As23)inthetreatentfautepryelytileukeia.As23induesNB4ellapptsisithdnregulatinfBl-2expressinanddulatinfPL-RARalpha/PLprtEins.Bld，1996，88：1052-1061.4郝红缨，滕智平，陆道培.PL-RAR合蛋白在三硫化二砷诱导的NB4细胞凋亡中的作用研究.中国实验血液学杂志，2002，10：108-111.5刘辉，邱镜滢，陆道培，等.砷剂治疗急性早幼