一种检测电芬顿体系下DNA损伤的电化学生物传感器的研制

1、一种检测电芬顿体系下DNA损伤的电化学生物传感器的研制摘 要：为了检测电芬顿体系下DNA的损伤，先采用石墨烯制备了一种致密的rGO/ Fe3O4复合材料；再将复合材料和DNA修饰到玻碳电极上，利用电化学还原作用释 放游离态Fe2+，并加入H$O$形成电芬顿体系；最后构建了一种检测电芬顿体系下 DNA损伤的新型电化学生物传感器。检测结果表明，检测DNA损伤的最佳时间为 30 min，最佳pH值为7.0。关键词：电芬顿体系；DNA损伤；rGO/Fe!。复合材料；电化学生物传感器Construction of an Electrochemical Biosensor for Detecting DN

2、ADamage in t6e ElectroFenton Syste4In order to detect the DNA damage in the electrofentonsystem, compact rGO/ Fe3。 composite material was prepared with graphene at first.Then the composite material and DNA were modified onto glassy carbon electrode, and the free state Fe2m was released by electroche

3、mical reduction, and H$O$ was added to form an ElectroFenton system. Finally ,a novel electrochemical biosensor was constructed to detect DNA damage in the ElectroFentonsystem.The experimental results showed that the optimal detecting time of DNA damage was 30 min, and the optimal pH value was 7.0.k

4、ey words： ElectroFenton system; DNAdamage; rGO/F。！。 composite material; electrochemical biosensor0引言脱氧核糖核酸(dna)是一种重要的生物分 子，含有遗传信息。环境中的一些物理和化学因 素，如电离辐射、生物毒素、代谢产物等，产生的活 性氧(reactive oxygen species, ROS)会使 DNA 发 生氧化损伤n，使DNA结构异变,其中活性氧族 主要包括过氧化氢、羟基自由基和超氧阴离子等。 研究表明，过氧化氢与亚铁离子构成的氧化体系 被称作芬顿体系，芬顿体系下产生的羟基自由 基作为

5、一种常见的ROS，会引发人体DNA的损 伤，导致基因组拼接不稳定,引发与癌症和衰老等 相关的多种生物学疾病。纵观传统的DNA损伤 的检测方法，如荧光法、毛细管区带电泳法、气相 色谱/质谱联用法、3$P后标记法、凝胶电泳法、免 疫分析法等方法,尽管它们能有效地对DNA的损 伤进行定性或定量，但是通常比较费时、耗力且设 备昂贵，局限性也很明显。因此，有必要研制一种 新型的DNA损伤检测手段。本文拟利用石墨烯制备rGO/Fe!。复合材 料;再将复合材料和DNA修饰到玻碳电极上，利 用电化学还原作用释放游离态Fe2+，并加入H$O$ 形成电芬顿体系；研制一种检测电芬顿体系下 DNA损伤的新型电化学生物

6、传感器，最后探明检 测DNA损伤的最佳时间和pH值。1材料与方法1-1试剂配制与保存小牛胸腺双链DNA保存于-20 冰箱中。 小牛胸腺DNA储存液(c = 10 mg/mL)采用pH = 7.4的0.05 mol/L Tris-HCl溶液配制，保存于4 冰箱中。聚二烯丙基二甲基氯化铵(poly dimethyl diallyl ammonium chloride，PDDA)于室温 下保存。使用0. 1 mol/L磷酸缓冲液(phosphate- buffer saline，PBS)溶解等物质的量的铁氰化钾和 亚铁氰化钾制备成电化学的氧化还原标签溶液 (:Fe( CN) 63-/4-，c = 5

7、.0 mmol/L)，于 4 下避 光储存。使用0.1 mol/L PBS溶解计算量的三氯 化六氨合钉制备c = 50 mol/L的Ru( NH3) 6,溶 液，于4 下避光储存。1.2复合材料rGO/Fe!。的合成采用改进的Hummers方法制备氧化石墨 烯，获得石墨烯材料。然后称取0. 100 g氧化石 墨烯于去离子水中超声，得到稳定的分散悬浮液。 同时，取0.566 g的FeCl$ - 4H$O加入到上述分 散液中，并添加5 mL的0. 1 mol/L NaOH。室温 搅拌2 h后转移至反应釜中，180 下反应8 h,黑 色沉淀经过滤、洗涤后,60 下真空干燥12 h,得 到 rGO/F

8、e3O4 1.3电化学生物传感器的制备工作电极的预处理加：在湿润的麂皮上先后 用0. 05 m和0.5 m的氧化铝将玻碳工作电极 抛光打磨至平滑,然后依次用去离子水、无水乙醇 和去离子水超声10 min,最后用氮气吹干。电化学生物传感器的制备:首先取一定量的 rGO/Fe3O4超声分散在PDDA溶液中，用移液枪 吸取8 L新配制的PDDA-GO/Fe3O4溶液，滴加 在预处理后的玻碳工作电极表面后，在室温下自 然晾干;然后使用移液枪吸取8 L DNA溶液滴 加在玻碳工作电极上，在室温下自然晾干后，使用 去离子水彻底清洗玻碳电极;最后将修饰的玻碳 电极连接直流电源的负极,将铂丝电极连接直流 电源

9、的正极，电源两极置于含5. 0 mmol/L H2O2 的PBS溶液中，设置电源两极之间的电位差为 1.5 V,电流为0.1 A,持续反应一定时间后，将电 极取出，用去离子水清洗(如图1所示)。图1电化学生物传感器的制备图Fig.l Preparation diagram of electrochemicalbiosensorDNA损伤的检测方法使用上海辰华仪器有限公司的电化学工作站 (CHI660E型)，三电极体系以修饰的玻碳电极为 工作电极，铂丝电极为对电极，银氯化银电极为 参比电极。采用循环伏安(cyclicvoltammetry, CV) 法和差分脉冲伏安(differential p

10、ulse voltammetry, DPV)法，在含 50 mol/L Ru( NH!) 63+ 的 0. 1 mol/L 的PBS溶液中检测DNA损伤后嘌吟碱基的氧化 信号，从而确定DNA的受损程度。差分脉冲伏安 试验参数设置为脉冲宽度：0. 06 s,脉冲振幅： 0. 05 V,扫描电压范围:0. 5 V到1. 1 V。循环伏 安试验参数设置为，扫描速率:0. 1 V/s，扫描电压 范围:-0. 5 V到 0.4 V。DNA损伤检测的最佳条件通过检测 0 min、10 min20 min30 min 和 40 min时各试验组DNA的腺嘌吟氧化信号,得到最 佳的检测时间。在pH为4、5、5

11、. 5、6、7、8和10的 条件下，通过检测DNA的腺嘌吟氧化信号，得到 最佳的检测pH值。2结果与讨论2.1 GO和rGO/Fe3O4复合材料的SEM表征采用场发射扫描电子显微镜对合成的GO与 rGO/Fe!。复合材料的表面形貌进行表征。如图 2中(a)、( b)为GO的扫描电镜图，放大倍数分别 为 200 和 2 000,( c)、( d)为 rGO/Fe!。的扫描电 镜图,放大倍数分别为6 000和30 000。由图2( a) 所示,合成的GO为片状且片径不均一的二维空 间结构，说明石墨经过化学反应后，成功剥离出单 层薄片结构，这与L.Shahriary等人的研究结果一 致10,从图2(

12、 b)看出，GO表面粗糙且附带大量 褶皱,失去了石墨表面原有的金属光泽。由图2 中(c)、( d)所示，rGO/Fe!。复合材料为球形粒 子,粒子直径约为385 nm,且粒子之间没有间隙。(c)放大倍数6 000(d)放大倍数30 000图2 GO与rGO/Fe3O4的扫描电镜图Fig.2 The SEM images of prepared GO and rGO/Fe3OR2.2电化学传感器的CV表征采用CV法监测电化学生物传感器制备过程 中的电化学信号变化。设置扫描电压范围为- 0.2 V到0. 7 V,根据不同扫描速率下的CV信号 的电流强度值，计算传感器的有效活性表面积。如图 3 所示

13、，在 5. 0 mmol/L Fe( CN) 6】3-/4- 中得到不同修饰电极的伏安特性曲线，符合经典 铁氰化钾电化学标签的电化学特征其中， 曲线1代表裸GCE,曲线2代表PDDA-rGO/ Fe3O4-GCE,曲线 3 代表 DNA-PDDA-rGO/Fe!。- GCE。裸电极在225 mV和309 mV处得到一对良 好的可逆氧化还原峰。阴极和阳极的电位差 (为84 mV。电极上修饰了复合材料后，电 位差(AEp)变为77 mV,峰值电流强度J = 199. 9 A)较裸电极的电流强度(J = 166. 5 A)也有所 增加，表明了复合材料rGO/Fe!。加速了玻碳电 极与氧化还原标签之间

14、的电子转移速率。当电极 表面修饰了 DNA后，阴极与阳极的电位差)Ep 增长至221 mV,这是因为DNA的磷酸骨架结构 呈负电性，氧化还原标签的反应动力学受到限制， 降低了氧化还原反应的可逆性皿。-100-150E/V(vs.Ag/AgCl)1-100-150E/V(vs.Ag/AgCl)1裸 GCE； 2PDDA-rGO/Fe3O4_GCE；3DNA-PDDA-rGO/ Fe3 O4 -GCE图3不同修饰电极上的CV曲线图Fig.3 Typical CV curves of different electrodes根据扩散控制原理假设所得的Randles- Sevcik方程，如式(1)所示

15、,计算修饰电极的有效 活性表面积：15-17:Ip = 2.69 x 105AD1 2/铲2c( 1)式中：Ip指电流强度(A) ,$指电子转移数目,A指 rGO/Fe,。复合材料修饰电极的有效活性表面积 (cm2) ,D 指扩散常数(6.700.02x10A6cm2/s) 指扫描速率(V/s) ,c指:Fe( CN的浓度 (mol/mL) #设置扫速为 0. 01, 0. 03, 0. 05, 0. 08, 0. 1, 0. 15,0.2,0.25,0. 3 V/s，获得不同扫速下的CV 曲线，如图4所示。根据循环伏安曲线的电流强 度获得Ip与)1/2的线性相关图(如图5所示)，将 曲线的斜

16、率带入式(1),从式(1)可以得出复合材 料修饰电极的有效工作面积为0. 143 cm2。E7V(vs.Ag/AgCl)图 4 PDDA-rGO/Fe3O4-GC 电极在不同扫速下的CV曲线图Fig.4 CV curves of PDDA-rGO /Fe3 O4-GCelectrode under different scan ratesFig.5 The calibration plot for the peak currents vs. the square root of scan rate2.3 DNA损伤的检测结果如图6为Ru( NH3) 63+标签下的CV曲线。 图6中结果显示，-

17、0.2 V附近出现信号峰，属于 Ru( NH3) 63+标签的特征峰，与R-Imani等人的研 究结果一致18,本研究中-0.212 V和-0. 145 V 处得到的两个信号峰分别对应Ru( NH3) 62+/3+的 氧化和还原反应。其中，曲线1代表DNAYDDA- rGO/Fe3O4-GCE的CV曲线，曲线2至曲线5分 别为反应 10 min20 min30 min40 min 后的 CV 曲线。DNA发生损伤后，还原峰强度逐渐增加， 因为DNA损伤后暴露出的嘌吟碱基参与电化学 氧化还原反应，促进了 Ru( NH3) 63+的还原，使还原峰强度增加。损伤过程描述为如下反应方 程式：, 0H

18、TOC o 1-5 h z DNADNA( adenine+guanine)( 1)Ru( NH3) #+DNA( adenine+guanine) #Ru( NH3) #+ +DNA( adenine+ +guanine+)( 2)1一0 min; 2一10 min; 3一20 min; 4一30 min; 5一40 min。图6不同反应时间后电极的CV曲线Fig.6 CV curves of electrode after differentreaction time0.50.60.70.80.91.01.1E7V(vs.Ag/AgCl)采用差分脉冲伏安法可以检测嘌吟的氧化峰 信号邸，如图

19、7所示,0. 65 V处出现微弱的鸟嘌 吟氧化峰,0.92 V处出现腺嘌吟氧化峰。其中， 曲线 1 代表 DNA-PDDA-rGO/Fe3O4-GCE 的 DPV 曲线,曲线2至曲线5分别为反应10 min20 min、 30 min40 min后的DPV曲线。随着DNA损伤程 度的增加，暴露的嘌吟碱基量增加，嘌吟的氧化信 号强度也随之增加。0.50.60.70.80.91.01.1E7V(vs.Ag/AgCl)2.4 DNA损伤检测的最佳条件2.4.1检测DNA损伤的最佳时间如图8所示，腺嘌吟的氧化峰电流强度随反 应时间的增加而增加,30 min后，曲线基本持平， 说明腺嘌吟碱基几乎完全暴露,dna双链全部断 裂