分析化学课件：色谱通论 液相色谱

1、色谱通论&液相色谱1 概述 2 色谱法基本原理3 发展概况 (自学) 4 柱色谱5 薄层色谱法6 薄层扫描法7 纸色谱法 本章小结1 概述 一. 色谱法 (层析法)定义：利用各组分物理化学性质的不同，在流动相流经固定相时，由于各组分在两相间的吸附、分配或其它亲和力的差异而产生不同速度的移动，最终达到分离的目的。分离基础：差速迁移 (例:赛跑) 特点：效率高，灵敏度高，能把性质相近的物质彼此分 开，适合于干扰组分存在的混合物的分离分析。 二、分类 (一) . 以两相所处的状态分类： 流动相 固定相 类型 液 固 L-S色谱 液 液 L-L色谱 气 固 G-S色谱 气 液 G-L色谱 (二). 按

2、分离机理分类： (1). 吸附色谱: 利用吸附剂表面对不同组分吸附力不同而分离。 (LS 色谱 gS色谱) 固定相为固体的色谱。 (2). 分配色谱: (LL , gL). 利用各组分在两相间分配系 数不同进行分离。 (3). 离子交换: 利用不同组分对离子交换剂亲和力不同分离。 (4).分子排阻色谱: 利用某些凝固对不同组分因分子大小不 同而阻止作用不同，进行分离。(三). 按操作类型分类： 柱色谱：气相、高效、超临界流体、经典柱等等。 平面色谱：薄层、纸色谱（载体水）。 逆流分配：属液相色谱，目前已很少使用。2 色谱法基本原理 一. 色谱过程： 物质分子在相对运动的两相间，分配“平衡”的过

3、程。 前面已讲其分离机制是差速迁移。例：顺、反偶氮苯在柱中吸附解吸附，再吸附 用化学方法无 法分离。柱中填氧化铝,将正、反体溶液加入流动相中冲洗,经吸附,解吸附流出曲线:二. 分配系数与保留行为的关系： 1. 分配系数：柱中分配平衡后，组分在固定相与流动相 中的浓度之比。 K =CS / Cm S固定相 m流动相 K与T有关。 对于不同的分离机理，K的含义不同: 吸附色谱 称 吸附系数 分配色谱 称 分配系数 离子交换色谱 称 离子交换系数 分子排阻色谱 称 分子排阻系数 2. 保留时间：从进样到某组分色谱峰峰顶的时间间隔， 为该组分的保留时间（tR ）。 保留体积：从进样到某组分色谱峰峰顶所

4、需流动相的体积 为该组分的保留体积VR。 死时间：不保留组分(不与固定相作用的组分)的保留时间 为死时间tm(即流动相的保留时间)。 死体积：Vm 保留时间是色谱的定性参数，同样组分，在同样色谱条件 下，tR 应相同。3. tR 与K 的关系： 设R为一个分子在流动相中出现的几率, 则固定相中1 R 。 ( 1- R) / R = CsVs/CmVm = KVs/Vm 整理后得: 1/ R = 1+ KVs/Vm 即有: 色谱基本关系式之一在一定的色谱条件下, tm、Vs、Vm为定值, tR与K呈线形关系。 组分的K大, tR大,后洗脱(后出峰)。 组分的K小, tR小,先洗脱(先出峰)。混合

5、物中各组分K相差愈大,各组分愈易彼此分开。K与组分、流动相、固定相、的性质和温度有关。而在色谱条件一定时, tR主要取决于组分的性质。因此, tR是定性参数。三. 分离机制: 在分类已简单提了一下,自己学习,后面用到时再详细 补充说明。 4 柱色谱有吸附柱色谱、分配柱色谱、离子交换柱色谱等。一. 液固 吸附柱色谱:固体吸附剂: 是一些多孔性物质,表面布满吸附点位(吸附中心)。吸附: 溶质在液固、气固 两相交界面上集中浓缩的现象。 它发生在固体表面上。(一) 色谱分离过程: X : 样品中各组分分子 Y : 流动相分子 Xm: 流动相中溶质 Ya: 吸附剂表面的流动相分子 Xa: 吸附剂吸附的溶

6、质分子 Ym: 流动相由Ya回到流动相中 吸附平衡常数: 由于流动相分子是大量的,所以Ym/ Ya 可视为常数。 Ka = Xa / Xm 吸附常数组分Ka越大, tR越长。(组分易被吸附,移行速度慢,保留值就大)。 洗脱曲线: (二)吸附等温线 一定温度,某组分在吸附剂表面吸附平衡,该组分在两 相中的浓度相关曲线。 1、直线形等温线是理想等温线,其所对应的色谱峰为对称 峰。即吸附剂表面没被溶质所饱和，斜率K=Cs/Cm，组 分流出速度不受浓度的影响。峰前不变形，后不拖尾。2、凸形：由于固体吸附剂表面活性不同，大多数液相色谱 非线形，且凸形较多。吸附剂表面具有吸附能力不同的 吸附点位，溶质在其

7、表面的分配系数不同。溶质分子先 占据强吸附点位，然后再占据次强的、弱的、最弱的。 强的吸附点位被饱和，在洗脱过程中，被强吸附的溶质 洗脱较慢，所以其洗脱峰呈拖尾峰。（减少进样量）3、凹形：由于进样量较大，影响了固定相的物理性质。随 溶质量的增加, Cs/Cm增加，所以呈凹形。 为防止流出曲线变形、拖尾，应控制溶质进样量。(三). 吸附剂的选择和吸附活度： 1. 对吸附剂的要求： (1)表面积大，具有一定的吸附能力。 (2)不应与流动相发生化学反应。 (3)粒度要细，一般要200目。 2. 吸附剂：常用的有：氧化铝、聚酰胺、硅胶等。 酸性pH = 54 分离酸性物质. 如氨基酸 (1) 中性pH

8、 = 7.5 氧化铝 分离生物碱. 如挥发油,甾体等 碱性pH =910 分离碱性. 如生物碱 (2) 硅胶: 吸附能力稍弱于氧化铝,用于分离弱酸活中性物(如 有机酸、氨基酸、甾体等)。硅醇基是使硅胶有一 定吸附能力的活性基团。 三种存在形式: 吸附能力 ： 活性大小 ： (3) 聚酰胺:由酰胺聚合而成的高分子物质。 其吸附原理利用分子内酰胺基和羰基,可与酚、酸、硝基 化合物等形成氢键。吸附力与能形成氢键的基团有关。 对位间位取代基均能形成氢键的,吸附力增大。邻位基团 间能形成分子内氢键的,吸附力减小。芳香核具有较多共 轭键时,吸附力增大。3. 吸附剂的活度： 氧化铝、硅胶的吸附力的大小, 与

9、其含水量有较大的关系： 活度级数 含水量 活度 吸附能力 小 少 大 强 大 多 小 弱 所以，加热除水，活度提高，吸附力加强。 加一定水，活度下降，吸附力减弱。 活化：105110加热除水为活化。 脱活：加一定水份，降低活性。 4. 薄层色谱法测Al2O3的活度: 把柱色谱法配置的染料溶液点在待测活性的氧化铝薄层板上(软板), 每种点24g , 用石油醚展开, 展距10cm, 观察染料斑点中心移动距离在10.5cm, 则此吸附剂为级。 (四) 流动相的选择: 流动相又称洗脱剂、展开剂或移动相。 要求: 1. 纯度高 2. 稳定(对样品和吸附剂不反应) 3. 对样品溶解度大 4. 粘度小(易洗

10、脱)。选择流动相应考虑三方面：1. 被分离物质的极性与结构: (1) 基本母核相同 , 基团极性愈大 , 分子极性愈大。 基本母核相同 , 极性基团数目愈多 , 分子极性愈大。 常见的取代基极性大小顺序: 烷烃 烯烃 醚类 硝基化合物 二甲胺 脂类 酮类 醛类 硫醇 胺类 酰胺 醇类 酚类 羧酸类 (2) 分子双键多, 吸附力 , 共轭度, 吸附性 。(3) 空间排列 , 影响极性。 如：2. 吸附剂的活度: 被分离物质的极性 吸附剂活度 大 应选 小 防吸附太牢,难洗脱 小 大 防tR太小,不易分离 3. 流动相: 相似相溶的原则 被分离物质的极性 吸附剂活度 流动相极性 大 小 大 小 大

11、 小 常用流动相极性强弱顺序: 石油醚 环己烷 四氯化碳 苯 甲苯几 乙醚 氯仿 醋酸乙酯 正丁醇 丙醇 乙醇、甲醇 1 , 说明B+ 较牢地结合在树脂上 KB/A 1 , 说明A+ 较牢地结合在树脂上 所以KB/A说明了树脂对A+、 B+两种离子选择性交 换的能力,故也称之为选择性系数。 KB/A , B与树脂结合能力强 , 洗脱慢 , tR 。2. 选择性系数与分配系数的关系: 即: 分配系数不同是离子交换分离的先决条件。 5 薄层色谱法TLC 操作流程: 铺板 活化 点样 饱和 展开 显色 定性 , 定量。 一. 原理: 将混合组分的试液, 点在铺了吸附剂的玻璃板一端, 在密闭容器中用适

12、当的溶剂 (展开剂、流动相) 展开, 各组分不断地被吸附, 解吸附 随展开剂前移, 利用吸附剂对不同组分的吸附力 (吸附常数)不同, 产生差速迁移, 而达到分离。 特点: 快速、灵敏(几几十微克)、 高选择、显色方便。二 参数: (一) 定性参数: 比移值 RfA= a / c RfB = b / c 讨论: Rf = 0 未移行 (被固定完全吸附, K ) Rf = 1 移至前沿 (组分不被固定相吸附, K 0 ) 一般: 0 Rf 1 Rf是薄层色谱的定性参数, 在同一色谱条件下, 同样结构 的分子由相同的Rf值。(例: SMZ、TMP) 某物质，当色谱条件一致时，Rf定值，定性用，但重现

13、 性差。有人建议用相对可比值定性。 参考斑可以是另加的物质,亦可以样品中另一组分为参考。 Rf值的大小, 主要取决于该组分在两相间的分配系数, 因此: Vm: 薄层板的死体积; VS: 板固定相体积; K: 该条件的分配系数 物质极性大, 吸附力强; 反之, 物质极性小, 吸附力弱。 Rf最佳范围: 0.30.5 , 也可控制在0.20.8使用。 (二)分离参数: 分离度 X1、X2色斑中心到原点的距离。 W1、W2两色斑的峰宽(扫描测定)。一般亦可用纵向直径。（三）容量因子相平衡参数三. 固定相 1. 吸附柱色谱的固定相薄层色谱也可以使用, 但薄层色谱所用的硅胶、Al2O3粒度比柱色谱更细。

14、 硅胶 40 m (一般要求200目左右) 常用硅胶GF254: 吸附剂(硅胶)、粘合剂(石膏),掺入荧光剂254 nm,呈黄绿色。 符号: 硅胶G 硅胶 + 石膏 硅胶H 硅胶(未加任何物质) 硅胶HF254 硅胶不含粘合剂+荧光物质 硅胶GF254 硅胶+石膏+荧光物质2. 铺板: 常用平滑的玻璃板,洗净待用。 软板: 吸附剂直接铺涂。最大缺点, 风吹即飞(已不用)。 硬板: 吸附剂+粘合剂糊状铺板凉干活化 常用粘合剂: CMC-Na 羧甲基纤维素钠。(0.250.75%的 CMC-Na水溶液与吸附剂3：1调粘研磨) 活化: 凉干的板在110活化1小时,于干燥器中备用。 四. 展开剂选择:

15、 (同柱)仅操作方法不同。 分离强极性物质, 选择强极性展开剂, 同时也应考虑固 定相的活性。 物质极性 吸附力 流动相极性 防止 大 强 大 太牢, Rf太小 小 弱 小 Rf太大 分离混合样品时, 展开剂选择一般规则: (1)先用单一的中等极性展开剂试一下。 (2)改用二元展开剂, 其比例要摸索。 目的: 改变展开剂的极性。 例: A、B两组分试样 A B 展开剂 苯 Rf 0.45 0.42 分不开 改为 苯+乙醇 Rf 0.38 0.52 可分开 能否说出 A、B哪一组分极性大？ 解：显然B的极性大。因为展开剂极性加大时, 极性大的组分 Rf(相似相溶)。 一般做实验组分Rf控制在0.

16、20.8之间。 五. 点样与展开: (一)点样 点样量一般在一几十g, 23 mm。 点样量太大, 斑易拖尾, 影响分离效果。 注: 有时用于薄层制备与分离提取时,条状点样。 点样位置: 距底边1.52cm处, 铅笔画线、点点。(二)展开: 先饱和1520分钟,再展开,防止边缘效应。 * 展开剂浸薄层板下端0.5cm, 不能浸住起始线, 层析缸 应密闭。 展开方式: 为单向展开,亦可双向展开、多次展开等。 六. 定性与定量: (一)定性: 找斑所在位(求Rf)对照。 1. 显色: 本身有色的可日光下显色 紫外灯下显色:主要用于荧光物质有明显荧光斑、有紫外吸收的物质。 荧光薄层板:用于有紫外吸收

17、的物质。 显色剂 (通用型显色剂：硫酸乙醇液或碘） 2. 定性分析: 比较组分与对照品Rf值。 对未知样品,要几个展开体系均有一致Rf值,才可认为同一物质。 (二)定量: 1. 目视比色:色斑大小、深浅 (误差大, 1030%) 2.洗脱法:刮下,溶解,光度法测定。 5 % (基本符合微量分析误差要求)。 3.薄层扫描: 误差 5 % (符合要求)。 6 薄层扫描法 一. 薄层扫描仪: 1. 光路: 如图-双波长双光束扫描,光 经过两个单色器得到1, 2的光, 由斩光器分别将光照在薄层板 上, 经放大后得到吸收度信号是 1和2的两波长吸光度之差。 2. 波长选择原则： 参比波长: , 化合物吸

18、收光谱的基线部分 (即无吸收或吸收最小的波长) 测定波长:, 通常选择化合物吸收峰波长。 如此测定消除了背景的吸收干扰,得到了 较好的曲线。 二. AC曲线: 不符合Beer-Lambert定律, 符 合Kubelka-mark (克曼方程)及 峰面积与进样量呈曲线关系。 透光率 T= i / I0 ( I0 : 照射光强, i:光透过微分 薄层上的入射光强 ) 反射率 R= j / I0 ( j : 为反射光强度 ) 透射法中: A = -lg T/T0 ( T0、R0空板透光率和反射率. 反射法中: R = -lg R/R0 T、R 斑点的透光率和反射率.) 三. 扫描条件的选择: (一)

19、 测光方式: 1. 吸收光度法: 透射法: A=-lg( T / T0) = lg ( T0/ T ) (用于透明板) 反射法: A = lg( R0/ R ) ( 适用于不透明层析板, 如硅胶板,Al2O3板 ) 2. 荧光法: 利用物质本身能发出荧光的强弱或板上暗斑(荧光淬 灭)进行定量。 荧光强度: F=I0 a b c ( : 效率, I: 入射光 , a: 系数, b: 薄层 c: 样品浓度)(二) 扫描方法: 直线扫描: 光束以直线轨迹通过色斑色斑外形 规则时用。 锯齿形扫描: 光束以锯齿形轨迹移动色斑外形 不规则时用。四. 定量方法: 1. 外标一点法: 标准曲线通过原点时,才能

20、用之。 m样 / m 标= A样 / A标 (A : 峰面积 ; m: 样品或标品的量) 2. 外标二点法: 标准曲线不通过原点时,用之。 用两种浓度的对照品液(或一种浓度、两种点样量)与 样品液对比定量。 m = a + b A样 式中: b = m1-m1/A1-A2 a = m1-bA1 7 纸色谱法 一. 基本原理 LL分配色谱 载体: 滤纸的纸纤维 固定相: 滤纸上吸附的水分(2026%水分中有6%的 水分通过氢键与纤维素 上的羟基结合成为 复合物) 流动相: 与水不相混溶的有机溶剂。 定性参数: Rf 操作类似于薄层,但原理却不同。 (一)Rf与K的关系: Rf大, K小, 极性小

21、的物质; Rf小, K大, 极性大的物质。 由式: K愈小, Rf愈大。各组分K不同,就有不同的Rf, 从而得以分离。 (二) Rf的影响因素: 1. 物质的化学结构: 极性大的物质, 水中分配多, Rf小。 极性小的物质, 水中分配少, Rf大。例: 葡萄糖 鼠李糖 洋地黄毒甙分子中羟基数 5 4 3亲脂性基团 0 CH3 CH2 , CH3分子极性 大 次 小 Rf 小 中 大 2. 色谱条件的影响: 展开剂的极性: 展开剂的极性,极性物质Rf ,亲脂性组Rf 。 展开剂蒸气: 对Rf影响较大, 所以应先让蒸气将层析缸饱和, 以免造成流动相的比例改变。 温度:二. 实验条件选择: 1. 选

22、纸: 质地均匀, 无折痕。 若Rf小, 选中速或快速滤纸; 若粘度大,选质地松 的滤纸。若组分多,选中速或慢速滤纸。一般常 选中速滤纸。 2. 点样: 一般几几十 g , 23 mm 3. 展开: 先饱和, 再展开, 与薄层类似。 4. 定性: Rf 显色：与薄层一样（无荧光薄层即硫酸显色） 5. 定量: 剪下,洗脱,光度法定量。 例样品在TLC上展开，10分钟时有一Rf值，但20分钟时的展开结果是：（ ）A、Rf值加倍 B、Rf值不变 C、样品移行距离加倍D、样品移行距离增加，但小于2倍 E、样品移行距离增加，但大于2倍答案：(D） 例2用纸色谱分离组分A、B、C，以乙醇：水：冰醋酸（7：2：1）为展开剂时，Rf值的大小顺序为RfaRfbRfc；若改用苯：丙酮：冰醋酸（7.5：2：0.5）为展开剂时，则Rf值的大小顺序可能是（ ）。A