微生物学-09b微生物与基因工程课件

1、9.1 基因工程概述9.2 微生物与克隆载体9.3 微生物与基因工程工具酶9.4 微生物作克隆载体的宿主第九章 微生物与基因工程9.5 表达载体的构建9.6 DNA的合成、体外扩增9.7 基因工程的应用基因工程技术基因工程（genetic engineering)：把分离到的或合成的基因经过改造，插入载体中，导入宿主细胞内，使其扩增和表达，从而得到大量基因产物，或令生物表现出新的形状。基因工程大事记1973 Cohen和Boyer第一次将重组体DNA转化大肠杆菌，实现了DNA的分子克隆;1978 Genentech公司-人胰岛素-世界上第一种基因工程蛋白药物 1982 第一个基因工程药物-重组

2、人胰岛素在英、美获准使用 1985 第一批转基因家畜（兔、猪和羊），中国 转基因鱼 1993 基因工程西红柿在美国上市1997 英国罗斯林研究所-克隆羊多莉1999.9 中国获准加入人类基因组计划, 负责测定人类基因组全部序列的1%2000.6.26 科学家公布人类基因组工作草图2001.2.11 公布人类基因组基本信息9.1 基因工程概述三项重要技术为基因工程奠定了基础:1967-1970年R.Yuan和H.O.Smith等发现的限制性核酸内切酶为基因工程提供了有力的工具；1972年Berg等将SV-40病毒DNA与噬菌体P22DNA在体外重组成功；1973年Cohen和Boyer第一次将重

3、组体DNA转化大肠杆菌，实现了DNA的分子克隆; 1977年Boyer等首先将人工合成的生长激素释放抑制因子14肽的基因重组入质粒，成功地在大肠杆菌中合成得到这14肽；1975-1977年Sanger、Maxam和Gilbert先后发明了三种DNA序列的快速测定法；90年代全自动核酸测序仪问世；一切基因工程操作都离不开微生物1、基因工程所用克隆载体主要是用病毒、噬菌体和质粒改造而成的。2、基因工程所用千余种工具酶是从微生物中得到的。3、微生物细胞是基因克隆的宿主。4、大规模表达基因产物，构建工程菌，利用工厂发酵来实现。5、提供基因资源（抗高温、高盐、高碱、低温等特性）。6、模式生物提供基础理论

4、。二、微生物与基因工程关系克隆载体应具备的性质1、可独立自主复制，具备复制原点；2、具有若干限制酶单一切割位点，且位于载体复制的非必需区，以便插入外源基因后不影响复制。3、有可供选择的遗传标记（抗性基因、显色反应），以便于对阳性克隆的鉴别和筛选。目前克隆载体种类质粒载体噬菌体载体柯斯质粒载体M13噬菌体载体真核细胞的克隆载体人工染色体。一、质粒载体1、特点：（1）具有独立复制起点；（2）具有较小的相对分子质量。1200kb，外源DNA15kb；（3）具有较高拷贝数，多为松驰控制型。人为增加拷贝数可用终浓度1020g/ml，氯霉素停止细胞蛋白合成，宿主DNA合成终止，质粒复制正常进行，可达数千个

5、拷贝；（4）具有便于选择的标记；（5）易于导入细胞，质粒可通过转化和电穿孔等方法导入细胞；（6）具有安全性。插入失活筛选转化子 插入失活：pBR322抗生素抗性基因内有许多单一切点的限制性位点，可以用来切开分子，插入新的DNA片段，新DNA片段的插入将导致相应抗性基因的失活，这种现象称如BamHI可以从四环素位点切开，使该基因不能表达，对四环素是敏感的，但仍能表达氨苄抗性基因。筛选重组pBR322 按照以下方法进行，将转化细胞培养于氨苄培养基中，只有转化细胞可以生长形成克隆，影印到四环素培养基上，不能在该培养基上生长的菌落可能就是目的克隆。pUC质粒载体一个复制起始位点具有更小的分子量：2.8

6、kb更高的拷贝数，每个细胞大约500各拷贝具有多克隆位点MCS区段携带了氨卞青霉素抗性基因（ampR）多克隆位点区位于lacZ基因中，在此位点上插入外源基因会导致lacZ基因失活，可利用蓝白斑筛选重组子 。质粒的不足（1）外源DNA15kb。（2）转化效率低，约0.1的转化率。噬菌体克隆载体的构建a、缩短长度野生型DNA包装的上限为50.5kb，本身长度为48.5kb，插入片段至多为2.0kb，如果将其缩短便能够提高装载量。I 插入型载体经改造后的长度为37kb，为包装的下限，插入片段最大为13.5kb（50.5-37kb）由于该类载体重组与否均可包装，因而为区分组子与非重组子必须携带标记基因

7、。b 删除重复的酶切口插入型载体在插入位点有一酶切口，但这必须是唯一的；取代型载体在取代位点有两个酶切口，多了也不行，而天然的DNA上有许多重复的酶切口，如：EcoRI 5个，HindIII 7个，这些多余的酶切口必须被删除噬菌体载体的优点可在体外包装成噬菌体，高效感染大肠杆菌装载外源DNA的量大（23kb）重组-DNA的筛选提取方便噬菌体载体常用于构建基因文库。柯斯质粒载体（COS载体，粘粒载体）考斯质粒是含有-DNA两端cos区的质粒考斯质粒的构建由于 -DNA包装蛋白只识别粘性末端的一小段顺序cos区。将这段DNA与质粒连在一起，构建的重组质 粒，可装载外源DNA（45.5kb)，它仍可

8、象-DNA一样，在体外被包装成有感染活性的噬菌体，进入细胞后，要通过质粒上的复制子进行复制。考斯质粒的优点能象-DNA一样体外包装，并高效导入受体细胞可以装载更大的外源DNA片段，可装载45.5kb。携带质粒的选择标记，便于筛选有质粒上的多种单一酶切位点，便于克隆。M13噬菌体载体1、 M13 噬菌体基本特点：（1） M13 噬菌体颗粒是丝状的，只感染雄性大肠杆菌。感染宿主后不裂解宿主细胞，而是从感染的细胞中分泌出噬菌体颗粒，宿主细胞仍能继续生长和分裂；（2） M13 噬菌体的基因组为单链 DNA ，由 6407 的碱基组成 ；（3）在宿主细胞内，感染性的单链噬菌体 DNA （正链）在宿主酶的

9、作用下转变成环状双链 DNA ，用于 DNA 的复制，因此这种双链 DNA 称为复制型 DNA （replicative form DNA） ，即 RF DNA ；M13噬菌体的改造野生型M13不适于作为克隆载体，因此人们对野生型M13进行了改造，构建了一系列M13克隆载体。在M13基因组中，除基因间隔区（IG）外，其他均为复制和组装所必需的基因。外源DNA插入IG区，可不影响M13活动，因此对野生型M13的改造主要在IG区中进行。 插入半乳糖苷酶选择标记在IG区中插入半乳糖苷酶N端一小段编码序列及其调控序列，该序列编码半乳糖苷酶的肽，肽可与大肠杆菌LacZ突变基因 M15进行互补，产生具有活

10、性的半乳糖苷酶。若将M13和宿主细胞涂布在含有异丙基硫代-D-半乳糖苷(IPTG)和呈色物质5-溴-4-氯-3-吲哚-D-半乳糖苷(Xgal)培养基的平板上时，可形成蓝色噬菌斑。 插入一小段多克隆位点区在肽的编码区内插入一小段密集限制酶单一位点的DNA片段，当外源DNA插入到这一区段，则会破坏互补作用。这时若将M13（含外源DNA）和宿主细胞涂布在含有IPTG和Xgal培养基的平板上，则形成无色噬菌斑。M13载体克隆外源DNA的能力较小，一般只适于克隆300400bp的外源DNA片段；它的突出优点是，特别适合用于制备克隆基因的单链DNA。因此，它主要被用于制备测序用单链DNA模板、特异的单链D

11、NA探针，定位诱变等。表9-1 几类大肠杆菌克隆载体比较载体类型 克隆外源DNA片段大小 主要用途 质粒载体 15kb 克隆和表达外源基因；DNA测序 噬菌体载体 23kb 构建基因文库和cDNA文库 柯斯质粒载体 45kb 构建基因文库 M13载体 300400bp 制备单链DNA；定位诱变；噬菌体展示 三、真核生物的克隆载体1.酵母质粒载体酵母质粒载体都是利用其2m质粒和其酵母染色体组分与细菌质粒pBR322构建而成的。可分别在细菌、酵母中复制，又称穿梭质粒。主要有三种：附加体质粒、复制质粒、整合质粒（1）附加体质粒（episomal plasmid） 结构：pBR322的复制起点、Amp

12、r（氨苄青霉素抗性基因）；2m的复制起点；酵母选择标记的URA3基因（尿嘧啶核苷酸合成酶基因3）。 细胞中拷贝数：酵母中高拷贝数。（2）复制质粒含有：来自细菌质粒pBR322的复制起点；氨苄青霉素抗性基因（Ampr）和四环素抗性基因（Tetr）。来自酵母染色体的自主复制序列（ARS）；作为酵母选择标记的URA3基因和TRP1基因（色氨酸合成酶基因1）。这种质粒是穿梭质粒，能在大肠杆菌或酵母细胞中复制，重组质粒导入酵母细胞中可获得中等拷贝数的质粒。（3）整合质粒含有：来自pBR322的复制起点；氨苄青霉素抗性基因（Ampr）、四环素抗性基因（Tetr）。来自酵母的URA3基因；它既可以作为酵母细

13、胞的选择标记，也可与酵母染色体DNA进行同源重组。这种质粒可在大肠杆菌中复制，但不能在酵母细胞中进行自主复制。一旦导入酵母细胞，可整合到酵母染色体上，成为染色体DNA的一个片段。2.真核生物病毒载体（1）哺乳动物病毒载体：目前利用许多哺乳动物病毒如SV40，腺病毒、牛痘病毒、逆转录病毒等改造后的衍生物作为基因载体。（2）昆虫病毒载体：主要为高克隆容量（100kb）；其次具有高表达效率（25）；安全，仅感染无脊椎动物；（3）植物病毒载体四、人工染色体酵母人工染色体（YAC）：能容纳最大外源DNA片段。1、组成：着丝粒（centromere，CEN）、端粒（telomere， TEL）、酵母自主复

14、制序列（ARS）、选择性标记（如URA3）。2、功能：大片段克隆（100万bp），多用于真核生物基因库的载体。3、相关：细菌人工染色体（BAC）。常用工具酶种类 内切酶 把DNA长链切割为短的片段 连接酶 将2段DNA片段拼接起来 聚合酶 催化合成形成核酸链 末端转移酶 片段末端加接多聚核苷酸 核酸酶 水解酶，非专一性 反向转录酶 逆转录酶9.3 微生物与基因工程工具酶一、限制性内切酶 1、限制性内切酶的定义 是指已被证明是限制修饰系统中的一个组成部分，具有识别双链DNA分子中的某种特定核酸序列并由此切割DNA双链结构的酶统称为限制性内切酶。限制性内切酶的发现 Luria和Human发现细菌能

15、将外来的DNA片段在某些专一位点上切断，从而保证其不被外来噬菌体所感染，而其自身的DNA由于被一种特殊的酶所修饰（甲基化）而得以保护，这种现象叫做限制修饰。Smith和Wilcox从流感嗜血杆菌中分离到一种酶，能够特异性的切割DNA，这个酶被命名为Hind I,这是第一个分离到的限制性内切核酸酶。3、限制性核酸内切酶的命名 按酶来源菌的属、种名而定，取属名的第一个字母与种名的头两个字母组成的三个斜体字母作略语表示；如有株名，再加上一个字母，其后再按发现的先后写上罗马数字。例如：从流感嗜血杆菌d株（Haemophilus influenzae d）中先后分离到3种限制酶，则分别命名为Hind、H

16、ind和Hind。4、限制性内切酶的类型 限制性内切酶可分为三大类型：类型I和类型III ：由于识别位点并非严格专一，很少被应用。类型II的特点: 识别位点严格专一；识别序列的碱基数一般为4、6、8个bp；识别位点经常是一种回文序列的DNA；是DNA重组技术最为常用的工具酶。寡核苷酸顺序具有二冲旋转对称轴，又称为回文顺序（palindromic sequence） GAA TTC CTT AAG也有一些对称顺序被一个或几个非特定的核苷酸间隔开。N-四种均可 Py-嘧啶 Pu-嘌呤如GTPyPuAC Hind I6、限制性内切酶的切割方式就切割位点相对于对称轴的位置而言,切割方式有三种:在对称轴

17、5 侧切割产生5 粘端在对称轴3 侧切割产生3 粘端在对称轴处切割产生平二、DNA连接酶配对的碱基产生的氢键还不足以把两个DNA分子拴在一起，还需要通过DNA连接酶在3羟基和5磷酸基团之间形成新的磷酸二酯键。大多数DNA连接酶都是从T4噬菌体中分离出来的，它可以催化在两条DNA链的末端形成磷酸二酯键，包括粘性末端碱基配对的两条DNA链和末端都是平末端的两条DNA链其它常用工具酶3. Tag DNA聚合酶：是一种耐热的依赖于DNA的DNA聚合酶，具有5 3聚合酶活性，该酶最适反应温度为7580 ，主要用途是进行PCR反应。4. 逆转录酶（依赖于RNA的DNA聚合酶）主要作用是将mRNA反转录成c

18、DNA（二）碱性磷酸酶其作用是去除DNA、RNA的5磷酸根（ 5-P），以防自身环化；另外在用32P标记5末端前，可先用其去除DNA或RNA上的5- P（三）核酸酶S1核酸酶：主要用于去除DNA片段粘末端而产生平端；打开cDNA中发夹结构，使其成平端。核糖核酸酶（RNaseA)：在质粒提取时降解RNA；从DNA-RNA杂交体中去除未杂交的RNA区。9.4 微生物作为克隆载体的宿主一、宿主的基本要求与性质1、能够高效吸收外源DNA；2、具有使外源DNA进行高效复制的酶系统；3、不具有限制修饰系统，故不会使导入宿主细胞内未经修饰的外源DNA发生降解；4、一般为重组缺陷型（RecA-）菌株，使克隆载

19、体DNA与宿主染色体DNA之间不发生同源重组；5、便于进行基因操作和筛选；6、具有安全性。二、原核生物宿主1、首先应根据克隆载体性质以及它们导入细胞的方式选择相应的宿主细胞：噬菌体载体E.coli k12菌株、M13含有F因子的雄性大肠杆菌。2、其次为了便于阳性克隆的筛选，作为克隆宿主的基因型应与载体基因相对应。3. 最后为了安全目的，需严格限制载体的宿主范围，以达到尽量避免重组体从实验室逃逸出去。三、真核生物宿主（酿酒酵母）利用真核生物作为克隆载体宿主具有两个重要意义。第一，它促进了对真核生物复杂基因组及其基因调控的研究；第二，它有利于真核基因产物的翻译后加工。酿酒酵母是一种理想的真核生物克

20、隆载体宿主。四、外源基因导入宿主1、外源DNA导入导入原核细胞（1）转化和转染：外源DNA以重组质粒载体形式存在，则可通过转化导入原核细胞；外源 DNA构建成重组噬菌体DNA或重组噬菌质粒，则可通过转染方式进入 宿主细胞。感受态细胞：用氯化钙处理宿主细胞，使细胞变得易于吸引外源DNA。（2）DNA的侵染（体外包装转染技术）体外包装（将重组DNA分子与噬菌体的头部、尾部以及有关包装蛋白混合，组装成具感染力的噬菌体粒子）感染宿主。较转染效率要高出104105倍。2、外源DNA导入真核细胞（1）外源DNA导入酵母细胞酵母细胞原生质体蜗牛酶CaCl2和聚乙二醇复合体（含DNA的原生质体）长出有壁细胞再

21、生培养基中（2）外源DNA导入哺乳动物细胞 其中最简便的是微量注射法和电穿孔法。（3）外DNA导入植物细胞： 除了微量注射法及电穿孔法可将外源DNA导入植物细胞外。 还有两种方法，一种是基因枪法或称微弹枪法；另一种是将含有重组Ti质粒的根癌土壤杆菌与植物原生质体共培养（即共培养法）或与植物叶片培养（即叶片培养法）。五、基因文库与cDNA文库的构建利用重组DNA技术，可将某一原核生物或真核生物染色体基因组的全部遗传信息，贮存在由重组体群体（如重组噬菌体群体）构成的基因文库(genomic library)或cDNA文库(cDNA library)1. 基因文库的构建所谓基因文库是指生物染色体基因

22、组各DNA片段的克隆总体。文库中的每一个克隆只含基因组中某一特定的DNA片段。一个理想的基因文库应包括该生物染色体基因组全部遗传信息（即全部DNA序列）。2、基因文库的构建步骤：（1）从组织或细胞提取基因组DNA；（2）用限制性酶部分水解或机械剪切成适当长度DNA 片段，经分级选出一定大小合适克隆DNA片段；（3）选择容载量较大的克隆载体，通常采用噬菌体或 柯斯质粒载体，在适当位点将载体切开；（4）将基因组DNA片段与载体进行体外连接；（5）重组体DNA直接转化细菌或用体外包装的重组噬 菌体颗粒感染敏感细菌细胞。最后得到携带重组 DNA的细菌群体或噬菌体群体即构成基因文库。2. cDNA文库构

23、建所谓cDNA文库是指生物体全部mRNA的cDNA克隆总体。cDNA文库中的每一个克隆只含一种mRNA信息。由于真核生物基因组十分庞大，因此要求构建基因文库的库容量要足够大，才能筛选到某一目的基因。但基于这样一个事实，即细胞中的mRNA分子数要比基因组的基因数小得多（通常大约仅有15%左右基因被表达），因而若由mRNA逆转录为cDNA，那么所构建的cDNA文库的库容量相应比基因文库小。构建cDNA文库的主要步骤：从生物体或细胞中提取mRNA。利用逆转录酶以寡聚(dT)或随机寡聚核苷酸为引物合成cDNA的第一条链。利用DNA聚合酶I，以cDNA第一条链作为模板，用适当引物合成cDNA第二条链;常

24、用RNA酶H在杂交分子的mRNA链上造成切口和缺口，产生一系列RNA引物;或是除去杂交分子的mRNA后，加入随机引物，即可合成第二条链。cDNA与载体的体外连接。噬菌体的体外包装及感染或质粒的转化。由于cDNA不含基因的启动子和内含子，因而序列比基因短，其克隆载体可选用质粒或病毒载体。六、重组体的筛选与鉴定1. 重组体表型特征的鉴定 2. 重组DNA分子结构特征的鉴定 3. 外源基因表达产物的鉴定 1. 重组体表型特征的鉴定(1) 抗生素平板法 (2) 插入失活法 (3) 插入表达法 (4) -半乳糖苷酶显色反应法抗生素平板法缺点:假阳性高插入失活法 因外源 DNA 的插入而导致基因失活的现象

25、，称为插入失活（ insertional inactivation ）插入表达法 在某些载体的标记基因前面连接一段负控制序列，当外源 DNA 片段插入该负控制序列中，使负控制序列失活，因而位于下游的标记基因因解除阻遏而得到表达。例如质粒 pTR262 有一个负调控的 cI 基因，当外源 DNA 片段插入 cI 基因中的 BcII 或 HindIII 位点，造成 cI 基因失活，位于 cI 基因下游的 tet 基因（受 cI 基因控制）因解除阻遏而被表达，转化后的重组体细胞，在含有四环素的平板中可形成菌落； - 半乳糖苷酶显色反应法 兰-白斑筛选：某些载体，如M13，PUC系列，PGEM质粒系列

26、等，都带有lac Z基因的一段序列，编码半乳糖苷酶的肽；而宿主细胞为Lac Z M15的突变株时， 肽可与M15进行互补，产生具有活性的半乳糖苷酶。若将转化细胞涂布在含有异丙基硫代-D-半乳糖苷(IPTG)和呈色物质5-溴-4-氯-3-吲哚-D-半乳糖苷(Xgal)培养基的平板上时，可形成蓝色菌落。当外源DNA插入到这一区段，则会破坏互补作用。这时若将转化细胞涂布在含有IPTG和Xgal培养基的平板上，则形成无色菌落。2. 重组DNA分子结构特征的鉴定菌落（或噬菌斑）原位杂交（ in situ hybridization ） 内切酶图谱鉴定 PCR 鉴定 菌落（或噬菌斑）原位杂交将转化细胞培养

27、在琼脂平板上，当形成菌落或噬菌斑后，再将硝酸纤维滤膜贴在平板上，使菌落或噬菌斑转印到硝酸纤维滤膜上。翻转此滤膜并置于另一不含菌的平板上培养，培养后的滤膜上可长出菌落或噬菌斑。取出滤膜，用裂解液处理使菌体裂解，释放出 DNA 。再用碱处理，使 DNA 变性，经烘烤将变性 DNA 固定于滤膜上。然后用放射性同位素标记的核酸探针进行分子杂交，并经放射自显影，黑点代表杂交上的菌落，即可筛选到阳性克隆。内切酶图谱鉴定 将初步筛选的阳性克隆小量培养后，提取重组质粒或重组噬菌体 DNA ，用 12 种内切酶酶切，然后进行凝胶电泳，检测插入 DNA 片段大小。 双酶切鉴定重组质粒 PCR 鉴定 通过与插入片段

28、两侧互补的引物，以重组质粒 DNA 作为模板进行 PCR 分析，可快速测出插入 DNA 片段大小及鉴定其序列特异性。 DNA 序列测定 最后为了确证目的基因序列的正确性，必须对重组体的 DNA 进行序列测定 外源基因表达产物的鉴定 表达产物免疫活性测定 表达产物生物活性检查 表达产物氨基酸序列测定 表达产物免疫活性测定Western blot with anti-Sak antisera (rabbit)表达产物生物活性检查表达产物氨基酸序列测定一般分析N-末端（15个残基序列）和C-末端（一般5个）氨基酸鉴别蛋白质的性质和同质性；9.5 表达载体的构建 基因工程的主要目的是使外源基因能在细菌

29、、酵母或动、植物细胞中得到高效表达，以便获得大量有益的基因表达产物或改变微生物或动、植物的遗传性状。 所谓表达载体（ expression vector ）是指宿主细胞基因表达所需调节控制序列，能使克隆的基因在宿主细胞内转录和翻译的载体。 用原核细胞表达真核生物基因时，应注意的问题 基因的编码区必须是连续的，因此要用切除内含子的 cDNA ； 基因必须置于原核细胞启动子、终止子和 SD 序列的控制之下，才能被宿主的转录与翻译系统有效识别； 产生的 mRNA 必须相对稳定并能有效进行翻译和蛋白质折叠。此外还要防止外源蛋白被宿主蛋白酶降解。 一 主要调控元件 启动子核糖体的结合位点转录终止信号（

30、1 ）、启动子 （ promoter ） 启动子是指 RNA 聚合酶结合于 DNA 并起始合成 RNA 的一段 DNA 控制序列。原核基因启动子位于转录起点（ transcription initiation ）上游（左侧），它由两段彼此分开且又高度保守的核心序列组成。一个称为 -10 区，位于转录起点上游约 10bp 处； RNA 聚合酶于该处解开 DNA 双链，并决定转录起点；另一个称为 -35 区，位于转录起点上游约 35bp 处，是 RNA 聚合酶识别并结合的位点。 原核表达系统中常用启动子 lac 启动子，是乳糖操纵子的启动子，受 lac I 编码的阻遏蛋白调节控制； trp 启动子

31、，是色氨酸操纵子启动子，受 trpR 编码的阻遏蛋白调控； tac 启动子，由 lac 启动子的 -10 区和 trp 启动子 -35 区融合而成，汇合了 lac 和 trp 两者优点，是一个很强的启动子，同样受 LacI 阻遏蛋白调控 。 P(L 、 R) 启动子，是噬菌体左、右向启动子，其温度敏感的阻遏蛋白受温度调控； T 7 噬菌体启动子，比大肠杆菌启动子强得多且十分专一，只被 T 7 RNA 聚合酶所识别。 核糖体结合位点原核微生物的 mRNA 结合核糖体的序列最初是由夏英（ Shine ）和达尔加诺（ Dalgarmo ）发现的，因此称为 SD 序列;在大肠杆菌中，核糖体结合点包括起

32、始密码子 (AUG) 及位于起始密码子上游 11bp 处，长度为 bp 的序列;这段序列富含嘌呤核苷酸，刚好与核糖体小亚基上 16S rRNA 3 端一段富含嘧啶的保守序列互补，从而带动核糖体与 mRNA 的结合。 转录终止子转录终止子指一段位于基因或操纵子的 末端，具有终止转录功能的特定 DNA 序列。高效表达载体应该含有终止子，因为合成的 mRNA 过长，不仅消耗细胞内的底物和能量，且易使 mRNA 形成妨碍翻译的二级结构。 密码子的偏爱性 由于密码子的简并性，一个氨基酸可有多个密码子。在原核生物细胞中，对于 tRNA 丰富的密码子称为偏爱密码子（ biased codons ），而对应于

33、 tRNA 稀少的密码子称为稀有密码子（ rare codons ） 二 表达载体中调节开关的作用 通常表达载体不应使外源基因始终处于转录和翻译之中。这是由于某些有价值的外源蛋白可能对宿主细胞是有毒的，外源蛋白的过量表达必将影响细胞生长； 宿主细胞的生长和外源基因的表达应该分成两个阶段进行。第一阶段使含有外源基因的宿主细胞迅速生长直至获得足够量的细胞。第二阶段是启动开关，使所有细胞外源基因同时高效表达，产生大量有价值的表达产物。外源基因表达常采用化学物质诱导与温度诱导两种不同方法。化学物质诱导 当用lac启动子构建表达载体时，lac启动子受CAP蛋白和cAMP的正调控。受阻遏蛋白的负调控；当宿

34、主细胞生长时，lac I基因产生的阻遏蛋白与lac操纵基因结合，阻碍外源基因的转录和表达，此时细胞大量生长和繁殖。加入诱导物IPTG后，由于诱导物与阻遏蛋白结合，使其不能与操纵基因结合。于是，外源基因被诱导而高效转录和表达。现在基因工程所用lac启动子常用其经紫外诱变改造的启动子lac UV5。该启动子失去CAP和cAMP的正调控，只要有乳糖或IPTG存在时就能够启动转录。温度诱导当用PL、R启动子构建表达载体时，PL、R启动子受噬菌体cI基因的负调控，cI基因产生的阻遏蛋白结合在操纵基因上，阻止转录的进行。目前利用cI的温度敏感突变基因（cI 857 ts）调节这种阻遏。当在28-30培养时

35、，该突变体产生有活性阻遏蛋白，阻遏PL、R转录，细菌大量生长。在获得足够量菌体后，使温度上升至42，造成阻遏蛋白失活，PL、R解除阻遏，启动外源基因的高效转录和表达，从而合成大量有价值的外源蛋白。三 非融合蛋白的表达 为了在原核细胞中表达非融合蛋白，可将带有起始密码子 ATG 的真核基因插入到合适的原核启动子和 SD 序列下游。经转录和翻译，就可在原核细胞中，表达出非融合蛋白。 外源蛋白的分泌表达 分泌型表达载体除具有一般表达载体的基本结构外，还需要具有编码信号肽的序列。通常信号肽与外源蛋白的 N 端连接，由于信号肽含有带正电荷的氨基酸和疏水氨酸，故能携带表达蛋白越膜分泌到周质或胞外，然后质膜

36、上的信号肽酶将信号肽切除。 包涵体 （ inclusion body ） 当外源蛋白在大肠杆菌高水平表达时，常常在细胞质内聚集而形成包涵体。利用大肠杆菌生产的非融合蛋白多数情况下以包涵体形式存在。 形成包涵体有利于外源蛋白的高水平表达和防止蛋白酶对其的降解，也可避免外源蛋白对宿主细胞的毒害。此外也有利于表达产物的分离。但包涵体形式的表达蛋白不具生物学活性，需要体外复性。四 融合蛋白的表达所谓融合蛋白是指蛋白质的 N 端由宿主基因（通常只是 N 端的部分序列）编码， C 端由外源基因编码的蛋白质，换言之，融合蛋白是由一条短的原核多肽和真核蛋白结合在一起的杂合蛋白。 表达融合蛋白的优点 融合蛋白较

37、易获得高效表达。融合蛋白的 N 端总是选择天然的高表达的宿主蛋白质，其 mRNA 具有较强的翻译能力；融合蛋白在细胞内比较稳定。外源蛋白特别是相对分子量较小的蛋白，通常在宿主细胞内极易被胞内蛋白酶所清除。但是如果构成融合蛋白，就可使外源蛋白不受宿主细胞降解；易于纯化。9.6 DNA的合成、体外扩增1 、 DNA 的合成 自 DNA 合成仪问世后，化学合成已可完全自动化，在半个小时内可合成 3035 个碱基的寡核苷酸。目前化学合成寡核苷酸片段的长度约为 150200 个核苷酸左右。PCR 扩增技术的原理和应用 聚合酶链式反应（ polymerase chain reaction, PCR ），是

38、一种在体外快速扩增特定 DNA 序列的新技术。如果 DNA 片段两端的序列是已知的，则先要合成一对寡聚核苷酸引物，它们各自与所需扩增的靶 DNA 片段的末端互补。 PCR 由 3 个基本反应组成。 变性: 加热，模板 DNA 经热变性，成为两条单链； 退火: 使温度下降，寡核苷酸引物即与模板 DNA 中所要扩增序列两端的碱基配对； 延伸: 在适宜条件下引物 3 端向前延伸，合成与模板碱基序列完全互补的 DNA 链。DNA 片段以 2 的指数增长，重复 2530 次循环，扩增的 DNA 片段拷贝数可增至 10 6 -10 7 倍。 PCR 扩增技术原理 PCR 技术的实际用途 可用于 DNA 的

39、扩增和克隆，制备单链或双链 DNA 探针；也可用于定位诱变和 DNA 测序。 在临床医学上可用于检测病原体，诊断遗传病，以及对癌基因的分析确定。 用于法医,以鉴别个体和判定亲缘关系。 基因诱变寡核苷酸介导的突变 盒式诱变 PCR介导的突变 9.7 基因工程的应用基因工程药物转基因植物转基因动物基因治疗在微生物研究中应用基因工程药物胰岛素人生长激素干扰素白细胞介素2粒细胞集落刺激因子粒细胞巨噬细胞集落刺激因子红细胞生成素 EPO组织纤溶酶原激活剂生长激素促生长素抗血友病因子脱氧核糖核酸酶葡糖脑苷脂酶鼠单克隆抗体基因工程药品 胰岛素胰岛素是治疗糖尿病的特效药。一般临床上使用的胰岛素主要从猪、牛等家

40、畜的胰腺中提取，每100kg胰腺只能提取45g胰岛素。用该方法生产的胰岛素产量低，价格昂贵，远不能满足社会需要。1979年，科学家将动物体内的胰岛素基因与大肠杆菌DNA分子重组，并在大肠杆菌内实现了表达。1982年，美国一家基因公司用基因工程方法生产的胰岛素投入市场，售价降低了30%50%。 干扰素是病毒侵入细胞后产生的一种糖蛋白。干扰素几乎能抵抗所有病毒引起的感染，是一种抗病毒的特效药。此外干扰素对治疗某些癌症和白血病也有一定疗效。传统的干扰素生产方法是从人血液中的白细胞内提取，每300 L血液只能提取出1 mg干扰素。19801982年，科学家用基因工程方法在大肠杆菌及酵母菌细胞内获得了干

41、扰素，是传统的生产量的12万倍。1987年上述干扰素大量投放市场。 基因工程药品 干扰素基因工程药品 生长激素 治疗侏儒症的唯一方法，是向人体注射生长激素。而生长激素的获得很困难。以前，要获得生长激素，需解剖尸体，从大脑的底部摘取垂体，并从中提取生长激素。 现可利用基因工程方法，将人的生长激素基因导入大肠杆菌中，使其生产生长激素。人们从 450 L大肠杆菌培养液中提取的生长激素，相当于6万具尸体的全部产量。 基因工程药物的生产过程1、目的基因的提取：分离或合成外源基因。2、体外重组：外源基因与载体体外连接，构建重组DNA分子；3、转化：重组DNA分子导入细胞。4、筛选与鉴定；5、基因表达：控制

42、适当条件，外源DNA表达。6、表达产物的纯化下面以胰岛素为例介绍基因工程药物的生产过程A链和B链分别表达法基因工程菌的构建战略：化学合成A链序列表达产物的后处理路线人胰岛素原表达法A链和B链同时表达法上述三种重组大肠杆菌的构建路线均采用胰岛素或胰岛素原编码序列与大肠杆菌b-半乳糖苷酶基因拼接的方法，所产生的融合型重组蛋白表达率高、稳定性强，但不能分泌，以包涵体的形式存在于胞质中。基因治疗1990年9月14日，美国马里兰州的Bethesda医院里，年仅4岁的女孩阿尚蒂(Asshanthi DeSilva)接受了人类历史上第一次基因治疗临床试验，为其主持治疗的是美国国立卫生研究院的CWBlease

43、教授、KWCulver教授和(French Anderson)教授等。 阿尚蒂忠有一种严重的复合型免疫功能缺乏症（SCID），这是一类致命性遗传性疾病。该疾病如果不加治疗，患者在l2年必死无疑。所幸的是世界上这种疾病非常罕见，在美国每年只有40名患儿出生。 阿尚蒂就是由于先天性缺乏腺苷脱氨酶(ADA)而导致SCID的,由于ADA酶的缺陷，人体细胞内脱氧腺苷大量积累，导致T淋巴细胞的中毒死亡；没有了T淋巴细胞，人体免疫系统就基本上被破坏了，这种情况类似于艾滋病患者晚期，很容易感染死亡。阿尚蒂只有生活在无菌的隔离病房，依赖没完设了的PEGADA酶的体外注射，通过这种外源ADA酶补充体内的不足ADA酶进入细胞谈何容易？低效的治疗，频繁的输注、昂贵的价格、潜在的病毒危害、免疫反应让阿尚蒂的生命看不到明天的希望。正是由于这种疾病的特殊性，该病成为基因治疗早期探索和开展临床试验的理想病种。1990年美国政府终于批准了世界上第一例基因治疗临床试验对阿尚蒂实施ADA基因治疗。医生和科学家们从阿尚蒂身上抽血，从中分离出少量的T淋巴细胞（患者体内T细胞数量很少），在体外进行生长和扩增，通过一种改造的反转录病毒将正常的ADA基因转移进去;虽然，这种方法并没有修复她缺陷的