基因表达调控 第三课 mRNA水平的研究9-29课件

1、 mRNA分析技术基因mRNA蛋白质多肽链基因表达基因表达的变化可以两个水平进行分析：mRNA 水平 和蛋白质水平mRNA表达变化的检测方法：Northern blot, RT-PCR(半定量PCR), Real-time PCR (定量PCR), 荧光原位杂交等、基因芯片、高通量测序等mRNA 表达变化的机制的研究方法方法有：启动子活性分析（转录水平分析）、mRNA转录效率分析（Nuclear run on）、mRNA稳定性检测（转录后水平）一、RNA研究策略和方法RT-PCR, Real-time PCR，Northern blot, RNA酶保护实验, 差异筛选，基因芯片Total RN

2、A：rRNA约占80-85，tRNA和核内小分子RNA约占10%-15%，mRNA约占1%-5%，琼脂糖凝胶电泳中只能看到：28S，18S，5S。RNA提取注意事项：要注意RNase的污染，因RNA极易被RNase的降解，操作时应尽量少说话，并在洁净的环境中操作，主要防止手、唾液和空气中RNase的污染；另一方面使用的所有玻璃仪器、移液器、吸头和离心管都用0.5%DEPC溶液处理过夜,然后高压灭菌15分钟.但对于灭菌的一次性使用的塑料制品基本上无RNase，可以不经处理直接用于提取RNA，实验室用的普通玻璃器皿和塑料制品经常有RNase污染，使用前必须180度干烤8小时或更长时间（玻璃器皿）或

3、用氯仿冲洗（塑料制品）提取用试剂：Trizol reagent（一）RNA的提取（二）RT-PCR（半定量PCR）RT-PCR相关试剂反转录引物反转录引物1防止RNA的降解，保持RNA的完整性。2. 避免gDNA的污染，用DNase处理。3为了防止非特异性扩增，必须设阴性对照。4内参的设定：主要为了用于靶RNA的定量。常用的内参 有GAPDH、-Actin等。其目的在于避免RNA定量误差、加样误差以及各PCR反应体系中扩增效率不均一各孔间的温度差等所造成的误差。5. 稀释cDNA，内参循环数20-26。6. 扩增产物长度300-500 bp。注意事项：引物设计原则在NCBI找到目的基因序列，以

4、CDS区进行引物设计。1.最好位于编码区5端的300-400bp区域内，可以用DNAman, Alignment 软件看看结果。2.引物长度一般在17-25碱基之间,上下游引物不能相差太大。3.G+C含量在40%-60%之间，45-55最佳。4.引物自身不能有连续4个碱基的互补。5.引物之间不能有连续4个碱基的互补。6.引物5端可以修饰。DNA 或RNA 的绝对定量分析，包括病原微生物或病毒含量的检测，转基因动植物转基因拷贝数的检测，RNAi 基因失活率的检测等。基因表达差异分析，例如比较 经过不同处理样本之间特定基因的表达差异 ( 如药物处理、物理处理、化学处理等 ) ，特定基因在不同时相的

5、表达差异以及cDNA 芯片或差显结果的确证。基因分型，例如SNP检测，甲基化检测等。Real-time PCR的应用：BAReal-time PCRRT PCR定量PCR引物设计软件：Primer bank将待检的RNA样品进行琼脂糖凝胶电泳，继而按照同Southernblot相同的原理进行转膜和用探针进行杂交检测。Northern blot主要用于检测样品中是否含有基因的转录产物（mRNA）及其含量。（四）Northern blotNorthern blot 流程图优点：northern blot的灵敏度要好于基因芯片实验，而基因芯片优势在于 它可在一次实验中同时反映出几千个基因表达量的变化

6、； 与定量PCR的高灵敏度相比，northern blot较高的特异性可以有效 的减少实验结果的假阳性。缺点： Northern blot 实验中要防止RNA的降解，所有实验用品都需要经 过除去RNA酶的过程，如高温烘烤、DEPC处理等。同时， northern blot中很多实验用品如甲醛、EB、DEPC、紫外灯等对人 体都有一定的伤害。Northern blot 的优势在于它可检测目的片段的大小、是否具有可变剪切出现、可允许探针的部分不配对性，杂交过后的膜经过一定的处理除去探针后还可保存很长时间再次杂交使用。（五）核糖核酸酶保护实验（ribonuclease protection assa

7、y，RPA）是灵敏度和特异性很高的mRNA定量分析方法 基本原理： 将标记的特异RNA探针（32P或生物素）与待测的RNA样品液相杂交，标记的特异RNA探针与目的RNA结合，形成双链RNA，免受RNA酶的消化；而未结合的单链RNA经RNA酶A或RNA酶T1消化形成寡核糖核酸。核糖核酸酶保护实验原理示意图32P标记的探针：杂交双链进行变性PAGE， 用放射自显影或磷屏成像系统检测探针的信号；生物素标记的探针：杂交双链经过变性PAGE后，电转移至尼龙膜，用链霉亲和素辣根过氧化物酶和化学发光底物与膜上biotin标记的探针结合，X射线胶片或化学发光图像分析仪检测杂交信号。RPA比Northern B

8、lot的优势：1. 过量的探针与目的基因的杂交在液相环境完成，反应更加完全 2. RPA比Northern Blot灵敏15-150倍，适合检测各种表达水平之基因 3. RPA通量高，同时检测多个基因，可评价他们在同一情况下的差异表达 4. 一次RPA就能完成10 多次Northern Blot的工作，加快研究速度可对细胞或组织中原位表达的mRNA进行区域定位标记探针特异性地与目标靶mRNA序列杂交，检测标记信号来确定基因在组织和细胞内表达的区位信息。可作为定量分析的补充。（六）原位杂交（in situ hybridization，ISH）什么情况下选择原位杂交？没有合适的抗体，不宜做West

9、ern blot检测；样本量太少或比较复杂，不宜提取RNA或蛋白。原位杂交技术主要步骤：材料处理及细胞样品的固定；样品的制备和预处理；探针的制备和预杂交；探针及样品的变性；杂交温育；检测杂交信号，进行结果分析。（七）差异表达基因筛选方法表达序列标签(expressed sequencing tag，EST) 技术，1991差异显示RT-PCR(different display reverse transcription PCR，DDRT-PCR)，1992 抑制性差减杂交(suppression subtractive hybridisation，SSH)，1996 基因芯片(gene ch

10、ip or micrOarray)基因表达的系列分析(serial analysis of gene expression，SAGE)，1995 基于高通量测序的数字基因表达谱(DGE)分析转录抑制剂：actinomycin D (ActD), 放线菌素D5,6-dichloro-1D-ribofuranosyl-benzimidazole (DRB),-amanitin (-Am)（八）mRNA稳定性分析荧光素酶报告基因分析系统二、mRNA稳定性调节的机制AU-rich elements (AREs) : AUUUA, 7-9% of cellular mRNAsThese elements

11、 are recognized by trans-acting factors, such as mRNA-binding proteins that bind directly or indirectly to the cis-acting elements and promote the deadenylation and degradation of the mRNA.AU-rich element RNA-binding protein 1 (AUF1), tristetraprolin (TTP) ,KH-type splicing regulatory protein (KSRP)

12、embryonic lethal abnormal vision (ELAV)-like protein 1 (HuR) and polyadenylate-binding protein-interacting protein 2 (PAIP2)（1）AU-rich sequences and mRNA binding proteins（2）Regulatory non-coding RNAmiRNAs act by pairing to the mRNAs of protein-coding genes to direct their repression. lncRNAs show di

13、fferent mechanism of action, varying from chromatin remodeling, transcriptional responses and RNA processing.（3）Alternative polyadenylation (APA)APA consist of two steps, cleavage and polyadenylation of RNAs, which are maturation events that cut and add an oligo(dA) tail to the 3 end of the nascent

14、transcript. This processing protects mRNAs from degradation and increases their stability.The specific cleavage position and the efficiency of the process depend on the interaction between trans-acting polyadenylation factors and cis-elements present in the pre-mRNAs, such as the central sequence motif AAUAAA.Most mRNA regulatory elements are situated within the 5 and 3untranslated regions (UTRs).The mRNA stability is regulated by the complex interplay of cis-acting equences within the 3UTR of the mRNA a