动植物细胞大规模培养课件

1、动植物细胞大规模培养胖虹彦20111052122细胞融合技术细胞融合(cell fusion)，是在自发或人工诱导下，两个不同基因型的细胞或原生质体融合形成一个杂种细胞。基本过程包括细胞融合形成异核体(heterokaryon)、异核体通过细胞有丝分裂进行核融合、最终形成单核的杂种细胞 细胞融合技术的主要过程1.制备原生质体2.诱导细胞融合3.筛选杂合细胞影响原生质体制备的因素1.亲本的选择及预处理2.除壁酶的选择3.酶浓度4.酶解温度5.酶解时间6.渗透压稳定剂原生质体融合方法1.生物学法（动物细胞融合）2.化学融合剂法3.物理法融合子的选择融合子的选择主要咦靠两个亲本的选择性遗传标记，在选

2、择性培养基上，通过两个亲本的遗传标记互补而挑选出融合子。融合后的情况：1.真正的融合，即杂合体或重组体2.暂时融合，形成异合体。动植物细胞大规模培养技术动植物细胞在体外条件下的存活或生长，此时细胞不再形成组织。组织培养是指从机体内取出组织或细胞，模拟机体内生理条件，在体外进行培养，使之生存和生长。此时培养物可能保持组织分化和组织结构功能。动物细胞大规模培养技术流程机体组织-切碎-酶解-离心收集-单细胞-培养-种子-液氮冷藏-复活培养-扩大培养-反应器大规模培养动物细胞培养工艺1、培养流程 （1）将动物组织切成碎片； （2）用胰蛋白酶处理，分散组织得到单个细胞； （3）离心收集细胞； （4）植入

3、营养培养基，细胞增值到覆盖瓶壁表面； （5）用胰蛋白酶消化使细胞从瓶壁脱落，再接种到培养瓶扩大培养； （6）获得足够量的细胞； （7）接入大规模培养生物反应器； （8）回收产品。动物细胞的培养特性1.细胞生长缓慢，易受微生物污染，培养时需用抗生素；2.动物细胞较微生物大得多，无细胞壁，机械强度低，适应环境能力差；3.培养过程需氧量少，且耐受强力通风与搅拌；4.在机体中，细胞相互粘连以集群形式存在，培养过程具有群体效应、锚地依赖性、接触抑制性及功能全能性；5.培养过程产物分布于细胞内外，反应过程成本较高，产品价格昂贵；6.大规模培养时，不可套用微生物反应的经验；7.原代培养的细胞一般繁殖50袋即

4、退化死亡。动物细胞的营养需求及培养基培养基A、物理性质 1、pH值：正常成纤维细胞：pH7.47.7；转化细胞：pH7.07.4。酚红的呈色： 2、缓冲盐：碳酸氢钠 3、渗透压 4、粘度紫色红带蓝红色橙色黄色呈色7.87.67.47.06.5pH培养基C、血清 1、常用血清： 小牛血清、胎牛血清、马血清、人血清 添加血清有助于细胞贴壁和生长。 2、血清提供的主要成分： 蛋白质、多肽、激素、代谢物和营养物、无机物细胞培养的环境要求A、支持物 1、玻璃 2、塑料 3、微载体B、气体交换 1、氧气：适合大气氧含量，一般不需特别调整。 2、二氧化碳：调整到5。C、培养温度 1、最佳温度的确定：a、动物

5、体温；b、细胞所在身体部位；c、考虑一定的安全系数。 2、细胞耐冷不耐热细胞大规模培养方式1.细胞悬浮培养法2.固定化培养法3.贴壁培养方法悬浮培养 (Suspension culture)悬浮适应细胞、源于循环系统的细胞及肿瘤细胞等非贴壁依赖性细胞无需支撑面 ,细胞或细胞聚集体悬浮于液体培养基中增殖. 悬浮培养是大规模细胞培养的理想方式.贴壁培养 (Monolayer culture)贴壁培养主要适用于贴壁依赖性细胞. 一般源于实体组织的细胞需要相互依赖 ,需贴附于不起化学作用的物质 (玻璃或塑料等无活性物质 )的表面生长、生存和维持 ,并最终在附着面生长至单层 ,铺满平面时便会发生接触抑制

6、.动物细胞大规模培养的条件控制培养装置培养条件培养装置分类1.悬浮培养器2.贴壁培养器3.微载体悬浮培养器细胞悬浮培养器实验室规模的培养装置：液体悬浮培养瓶动物细胞悬浮培养生物反应器带帆形搅拌器的连续灌注系统培养反应器实验室规模反应器，440L，搅拌桨是用尼龙丝编织带制成帆形，搅拌轴用磁力驱动旋转，转速为2050r/min，氧气通过插入溶液中的硅胶管扩散到培养液内，以维持培养液内一定的溶解氧水平。采用新鲜培养液连续加流，流出培养液通过旋转过滤器分离细胞后排出。用于培养鼠类肿瘤细胞，每升培养液得到1.71012个细胞。工业规模装置示意图中试和工业规模的动物细胞悬浮培养反应器：目前已有10m3规模

7、的动物细胞培养反应器用来培养杂交瘤细胞，生产单克隆抗体。关键是改进搅拌桨和通气装置，减小剪切力。用螺旋桨取代涡轮式搅拌器，用扩散渗透通气装置代替鼓泡空气分散器。动物细胞贴壁培养反应器大部分动物细胞必须附着在固体或半固体表面才能生长，细胞在载体表面上生长并扩展成一个单层，又称单层培养。传统方法：滚瓶用430L大小的成千上万个滚瓶进行动物细胞培养，来生产疫苗。比表面积小，0.35手工操作中孔纤维培养器由成束的中孔纤维管组成，每根中孔纤维管的内径为200m，壁厚为5075m，管壁是半透性的多孔膜，O2与CO2可以自由地透过膜双向扩散，而大分子有机物不能透过。动物细胞帖附在中空纤维管外壁生长，可以方便

8、地获取营养物和溶解氧。装置内可安装成千根纤维管，比表面积大(40)，溶解氧传质速率比悬浮培养器高3倍，为大规模动物细胞培养创造了条件。动物细胞微载体悬浮培养反应器 用微珠作载体，使单层动物细胞生长于微珠表面，可在培养液中进行悬浮培养。这种培养方式将单层培养和悬浮培养结合起来，是大规模动物细胞培养技术最常用方法。三个关键问题：具有合适的搅拌器，使载体在培养液内悬浮流动，而又要不因过高的剪切力而使动物细胞受到损害；不能用传统发酵罐那样用空气在培养液内鼓泡充氧，而只能用扩散方式来传递氧，以满足所需的溶解氧浓度；在培养液中严格控制pH值，要求误差小于0.05。动物细胞微载体悬浮培养反应器微珠可用葡聚糖

9、凝胶、聚丙烯酰胺、明胶或甲壳质等来制造，要求球径均匀，径差小于2025m，溶胀后密度在1.031.05g/ml，以便在反应器内经缓慢搅拌后微载体能悬浮起来。微载体其表面化学成分可以在细胞培养过程中促进贴壁依赖性细胞的附着和生长。微载体的主要优点是它们增加了比表面积，1个3升的微载体培养相当于26个850 cm2的滚瓶培养系统。它们可以使用在一个简单的滚瓶中或者高度控制的搅拌式生物反应器中。带中空纤维束的动物细胞微微体悬浮培养反应利用中空纤维作为通气装置的微载体悬浮培养反应器：用直径为2.5mm的聚四氟乙烯中空纤维管作为通气装置，空气在管内，氧分子通过半透性的管壁扩散到培养液中，供动物细胞生长。

10、锥形动物细胞培养反应器结构：圆锥形筒体，内装一个可旋转的塑料丝网气腔，在气腔的尖端部有螺旋桨搅拌器。气腔内有一圈气体鼓泡管。操作：螺旋桨的翻动使培养液循环流动，并使载体悬浮于培养液中。通过调节O2、N2、CO2和空气的配比控制培养液的pH值和溶氧浓度，满足动物细胞生长所需的条件。培养条件1.培养温度（370.5）2.溶解氧3.PH(7.27.4)4.罐压5.搅拌速度植物细胞大规模培养技术流程：外植体选择-消毒并切口-半固定培养基培养-愈伤组织三角瓶液体振荡培养-单细胞种子-液氮冷藏-复活培养-扩大培养-反应器大规模培养植物细胞培养流程植物细胞培养系统植物细胞营养需求 碳源蔗糖或葡萄糖是常用的碳

11、源，果糖比前二者差。其他的碳水化合物不适合作为单一的碳源。通常增加培养基中蔗糖的含量，可增加培养细胞的次生代谢产物量。 有机氮源通常采用的有机氮源有蛋白质水解物(包括酪蛋白质水解物)、谷氨酰胺或氨基酸混合物。有机氮源对细胞的初级培养的早期生长阶段有利。L-谷氨酰胺可代替或补充某种蛋白质水解物。 无机盐类对于不同的培养形式，无机盐的最佳浓度是不相同的。通常在培养基中无机盐的浓度应在25 mmolL左右。硝酸盐浓度一般采用2540 mmolL，虽然硝酸盐可以单独成为无机氮源，但是加入铵盐对细胞生长有利。如果添加一些琥珀酸或其他有机酸，铵盐也能单独成为氮源。培养基中必须添加钾元素，其浓度为20 mm

12、olL，磷、镁、钙和硫元素的浓度在13 mmolL之间。 植物细胞营养需求 植物生长激素大多数植物细胞培养基中都含有天然的和合成的植物生长激素。植物生长激素分成两类：生长素和分裂素。生长素在植物细胞和组织培养中可促使根的形成，最有效和最常用的有吲哚丁酸(IBA)、吲哚乙酸和奈乙酸。分裂素通常是腺嘌呤衍生物。使用最多的是6-苄氨基嘌呤(BA)和玉米素(Z)。分裂素和生长素通常一起使用，促使细胞分裂、生长。其使用量在0.110 mgL之间，根据不同细胞株而异。 有机酸加入丙酮酸或者三羧酸循环中间产物如柠檬酸、琥珀酸、苹果酸，能够保证植物细胞在以铵盐作为单一氮源的培养基上生长，并且耐受钾盐的能力至少

13、提高到10 mmolL。三羧酸循环中间产物，同样能提高低接种量的细胞和原生质体的生长。 复合物质通常作为细胞的生长调节剂如酵母抽提液、麦芽抽提液、椰子汁和水果汁。目前这些物质已被已知成分的营养物质所替代。在许多例子中还发现，有些抽提液对细胞有毒性。目前仍在广泛使用的是椰子汁，在培养基中浓度是115 mmolL。 培养基的种类培养方式1.悬浮培养法：分批培养法、半连续培养法、连续培养法2.固定化培养法培养条件的控制1.光照影响光照时间的长短、光的强度对次生代谢产物的合成都具有一定的作用。一般来说愈伤组织和细胞生长不需要光照，但是光对细胞代谢产物的合成有很重要的影响。有人研究了光对黄酮化合物形成的

14、影响，结果表明，培养物在光照特别是紫外光下积累黄酮及黄酮类醇糖苷的所有酶活性均增加。通常光照采用荧光灯，或者荧光灯和白炽灯混合，其光强度是30010000 lx(6100 mm2s)，可以连续光照，也可以每天光照1218 h。 培养条件的控制2.温度影响：植物细胞培养通常是在25 左右进行的，因此一般来说在进行植物细胞培养时很少考虑温度对培养影响。但是实际上，无论是细胞培养物的生长或是次生代谢产物的合成和积累，温度都是起着一定的作用，需要引起一定的重视 。培养条件的控制3.培养基成分的影响尽管植物细胞能在简单的合成培养基上生长，但营养成分对植物细胞培养和次生代谢产物的生成仍有很大的影响。营养成分一方面要满足植物细胞的生长所需，另一方面要使每个细胞都能合成和积累次生代谢产物。普通的培养基主要是为了促进细胞生长而设计的，它对次生代谢产物的产生并不一定最合适。一般地说增加氮、磷和钾的含量会使细胞的生长加快，增加培养基中的蔗糖含量可以增加细胞培养物的次生代谢产物。 培养条件的控制4.搅拌与通气的影响：植物细胞在培养过程中需要通入无菌空气，适当控制搅拌程度和通气