南方医大癌生物学讲义16-3肿瘤的合理治疗（下）

第十六章（3）肿瘤的合理治疗（下）前言：上一节，我们介绍了靶向EGFR和蛋白酶体的抑制剂，今天我们就来介绍靶向另外3个靶点的抑制剂——Smo蛋白、mTOR

和

B-Raf。

Smo拮抗剂抗肿瘤药物的一个重要潜在来源就是自然界中存在的化合物。植物来源产物环巴胺

(cyclopamin,西洛帕明）的发现就是一个很好的例子。这个奇特的故事起始于观察到美国西部高地牧草羊群的小羊有时候出现流行性先天畸形，它们大多数生下来就是死胎。最极端的畸形是独眼——小羊只有一个中间单眼。20世纪50年代开始的兽医研究工作发现，如果怀孕的母羊在怀孕第14天吃了假藜芦（藜芦属)就会产下独眼的新生羊羔。如果在怀孕早期或晚些时候吃了假藜芦就会出现其他的畸形（如腭裂和短腿）。1968年之前，对假藜芦引起的致畸效应的追踪研究发现了一种后来称为环巴胺的生物碱,它能在多数有机体中诱导独眼畸形。图1：假藜芦引起的胚胎畸形许多这类畸形与人类中称为前脑无裂畸形的疾病相似，人类这种畸形胎儿是由于

PTCH(patched)

受体基因或编码其配体的

SHH(sonichedgehog)基因发生遗传种系突变引起的。目前已经发现了23种SHH突变和3种PTC突变与这一情况有关。这些发现第一次提示环巴胺这一强烈的致畸药物能够干扰Hedgehog激活的信号通路。在这个信号通路中，Gli转录因子的前体通常在胞质中被裂解，分解后的一个片段入核发挥转录抑制因子的作用。质膜定位蛋白Smo(Smoothened)能保护Gli转录因子前体蛋白免受裂解，但这一作用通常被质膜中Ptc受体蛋白通过尚不清楚的机制所抑制。然而，当Hh(Hedgehog)配体与Ptc结合后，Ptc失去抑制Smo蛋白的作用。Smo则进入初级纤毛蛋白保护Gli蛋白免受正常情况下发生的裂解。完整的Gli能从初级纤毛运动到核内作为锌指结构转录因子诱导基因表达。Hedgehog结合Patched后产生的效应可以用突变的方法造成Ptc功能缺失或Smo功能获得来模拟，这些基因突变在皮肤基底细胞癌中很常见。图2：Patched-Smoothened信号通路在皮肤基底细胞痣综合征(BCNS)中检测到Patched编码基因存在胚系突变。皮肤细胞PTCH基因座杂合性缺失(LOH)会使痣朝着基底细胞癌(BCC)演变。此外，基底细胞癌是最常见的UV照射导致的皮肤肿瘤，近半数散发性基底细胞癌存在PTCH基因失活突变或SMO基因的激活突变。不过幸运的是，这些皮肤癌相对预后较好和容易治疗。但是这两个基因存在等位基因突变的其他肿瘤，尤其是肌细胞和小脑来源的肿瘤(成神经管细胞瘤)则不是这样。2000年研究者发现环巴胺能直接抑制Smo蛋白,而且这种相互作用阻滞了Hh过度表达或SMO基因突变所造成的异常信号转导。这表明环巴胺的致畸效应是直接由胚胎发育期阻滞Hh信号通路的重要环节而导致的。环巴胺与Smo相关性的发现随后引发了用环巴胺治疗多种Hh阳性的人类肿瘤细胞系的尝试，其对肿瘤细胞增殖的抑制程度达到75%~95%。例如，体外培养的人成神经管细胞瘤细胞具有较强的Hedgehog信号通路活性，能对环巴胺产生显著的治疗反应，导致细胞生长停止并快速失去活性；而另外两种Hedgehog未激活的脑肿瘤细胞（胶质母细胞瘤和室管膜瘤）中环巴胺未能产生治疗反应。环巴胺对其他无Hedgehog信号通路激活的肿瘤细胞系也不能产生治疗作用。另外，环巴胺能彻底阻滞胆囊肿瘤（另一种分泌Hedgehog的内胚层肿瘤）细胞在小鼠模型中的肿瘤形成能力。大约70%人胰腺癌存在高水平的Hh表达，表明Hh-Smo-Ptc-Gli信号通路的活化是这些肿瘤生长程序的内在部分。图3：环巴胺的治疗效果成年鼠长时间应用治疗剂量的环巴胺至今没有任何毒性作用的表现。然而，有3个主要问题动摇了环巴胺作为有效抗肿瘤治疗候选药物的潜力。首先，与其他天然产物相类似，环巴胺是一系列复杂酶反应的最终产物，这一复杂的酶反应过程很难通过有机合成化学实验来实现。其次，要从假藜芦中得到足够大量的产物是不实际的。最后，尽管已经在小鼠体内得到了以上结果，但是在人体内环巴胺仍然产生了过高的毒性作用。因此，在环巴胺的基础上研发了无毒性但具有类似环巴胺阻断Hh信号通路能力的Smo拮抗剂，而且这些药物对其他细胞受体的影响很小。Hh信号对胰腺癌进展具有非常多元的作用。一般来说，在许多肿瘤中，自分泌Hh驱动肿瘤进展，因为这类肿瘤细胞分泌Hh配体同时表达Patched受体，此情况已在胰腺癌基因工程小鼠模型中确证，然而，旁分泌Hh信号在这些肿瘤的进展中具有更重要的作用。胰腺癌细胞释放能刺激肿瘤微环境中成纤维细胞和肌成纤维细胞增殖的SonicHh,胰腺癌特征之一就是具有这些间质细胞构成的致密结缔组织基质。此基质形成了阻碍化疗药杀伤内部肿瘤细胞的物理屏障,该现象能从一个方面解释为什么一些肿瘤几乎对所有类型的治疗都不敏感。所以Hh抑制剂可以用于阻断致密基质形成来和其他细胞毒性药物联合抗癌,这种新策略的临床效果目前还不清楚。雷帕霉素mTOR的故事也是从一个天然产物雷帕霉素开始的。雷帕霉素于1960年从太平洋中部一个广为人知的EasterIsland上RapaNui土壤中生长的吸水链霉菌中分离出来。20世纪70年代早期，一个制药公司把它分离出来作为抗真菌药物。在随后的几十年中发现雷帕霉素能够阻止真核细胞生长，而且对从酵母到哺乳动物的真核细胞具有广谱作用。图4：雷帕霉素后来发现即使极低浓度的雷帕霉素也有很强的免疫抑制能力。1999年美国FDA批准它作为器官移植（主要为肾移植）的免疫排斥药物。这一药物也称为西罗莫司，能够与其他免疫抑制药物发挥协同作用，尤其是与环孢霉素和类固醇药物联合应用来保证长时间的移植物移入不会引起移植者的严重副作用。有意思的是，环孢霉素产生的免疫抑制会在器官移植受者中增加产生肿瘤的风险。而雷帕霉素诱导的免疫抑制能够降低这些患者发生移植后淋巴增生紊乱的风险。雷帕霉素能够直接结合于低分子量蛋白FKBP12(分子量为12kDa的FK506结合蛋白)。一旦雷帕霉素-FKBP12结合成复合体,其就能够与mTOR相互作用，并导致其功能失活。mTOR是一个289kDa的丝氨酸/苏氨酸激酶，它的激酶结构域与PI3激酶和相关的酶相似。mTOR整合了包括营养利用和有丝分裂原在内的一系列输入(即传入细胞内部)信号，并进而调控葡萄糖摄入和蛋白质合成等一系列其他细胞生物学过程。具体过程为mTOR磷酸化两个关键的翻译调控分子：p70S6激酶(S6K1)和4E-BP1。S6K1的磷酸化导致4E-BP1磷酸化核糖体小亚基的S6蛋白，然后小亚基才能够参与形成核糖体（与核糖体大亚基相互作用）并参与蛋白质的合成。通过磷酸化4E-BP1(及4E-BP2),mTOR能够使4E-BP1/2释放关键的翻译起始因子eIF4E(真核起始因子4E)。eIf4E被释放以后就可以与其他一些起始因子结合成复合体，该复合体能够使核糖体起始特定mRNA的翻译过程，尤其是那些5'非翻译区有寡聚嘧啶的mRNA。这一系列反应过程使mTOR成为一个细胞生长的关键调控因子（而不是调控细胞增殖)。此外，mTOR被证明是Akt/PKB的一种关键上游活化因子。通过控制Akt/PKB通路，除了已知的调节细胞生长功能以外，mTOR还能够调控细胞凋亡和增殖过程。在下图中，mTOR出现在两个位置，反映了它与Raptor和Rictor两个伴侣分子相互作用的功能。mTOR-Rictor复合物与第三个蛋白分子GβL一起形成

TORC2复合体，通过生长因子以未知的方式激活Akt/PKB。mTOR-Raptor复合物与GβL形成TORC1复合体。目前我们已经清楚TORC1复合体负责激活蛋白质合成过程（通过磷酸化S6K1、4E-8P1和4E-BP2)。通过与FKBP12结合，雷帕霉素直接与mTOR-Raptor复合体结合，使其迅速失活。而且，雷帕霉素作用几小时以后，mTOR-Rictor也能够失活，最终抑制Akt/PKB通路。对于雷帕霉素抑制mTOR-Rictor复合体的机制还知之甚少。图5：mTOR通路雷帕霉素的肿瘤治疗作用很可能是其抑制了Akt/PKB信号通路，这些肿瘤表现出PI3K过度激活或PTEN表达缺失。在移植受者中长期使用雷帕霉素产生的副作用毒性也很低。在临床前试验中，雷帕霉素在小鼠身上用于诱导慢性免疫抑制的剂量水平能够强烈地抑制肿瘤相关的新血管生成及肿瘤生长。这一效应可能与内皮细胞及其前体细胞中Akt/PKB的3种同工酶之一Akt1在血管内皮生长因子(VEGF)刺激下的血管生成有关。图6：雷帕霉素的疗效2006年报道雷帕霉素能够诱导结节性硬化相关的星形细胞瘤消退。此后的几年中，依维莫司（雷帕霉素/西罗莫司的异构体，也称为癌伏妥）被FDA批准用于晚期肾细胞癌(RCC)和胰腺神经内分泌肿瘤(NET),以及巨细胞星形细胞瘤的治疗。维罗非尼新测序技术推动下的全肿瘤细胞基因组测序发现了大量新候选癌基因和抑癌基因。然而，这些新发现的候选基因中最重要的是一个已知的Ras-Raf-MEK-ERK信号通路。处于研究中的其他基因还包括C-Raf(早期称为c-Raf)及它的两个同家族分子，A-Raf和B-Raf,它们都能被GTP结合的Ras激活。C-Raf编码产物与Raf癌蛋白相似。2002年进行的序列分析发现超过半数的人皮肤黑色素瘤中携带突变的B-Raf等位基因。人90%的B-Raf等价基因突变涉及编码第600位氨基酸残基的密码子点突变，通常是正常编码的缬氨酸被谷氨酸取代。B-Raf的V600E突变与Ras癌基因的突变很相似，Ras癌基因的等位基因突变甚至以更高的频率影响到第12个密码子这一特定位置。有意思的是，在黑色素瘤和其他肿瘤类型中，B-Raf等位基因突变很少与Ras癌基因突变同时存在。这一互斥性的模式表明，Ras-Raf-MEK-ERK通路在这些不同肿瘤的发生过程中发挥着重要作用，并且这两个家族的等位基因突变在功能上是冗余的。图7：B-Raf等位基因点突变2011年，特异性靶向V600E突变型B-Raf蛋白的药物维罗非尼（以前称为PLX4032),在欧洲获批用于治疗转移性黑色素瘤，该药物很快也获得了美国的批准。维罗非尼虽然能使携带V600E型突变的转移性黑色素瘤患者生存期延长，但仍无法治愈疾病。这些肿瘤迟早会产生耐药并进而复发，并最终导致患者死亡。此外，有一定比例接受此药物治疗的患者会出现皮肤鳞状细胞癌，这明确提示该药物可能会剌激一些处于临床潜伏期的肿瘤发生进展。事实上，若肿瘤患者携带V600E以外的其他突变，维罗非尼的确会促进肿瘤生长。因此，使用该药物前对肿瘤进行序列分析非常重要。与RTK激酶相似，Raf蛋白以同源二聚体(如B-Raf：B-Raf)或异源二聚体(如B-Raf：C-Raf)的形式发挥作用。两个亚基间有明确的调节互作，维罗非尼结合到二聚体中的V600E型突变蛋白，会激活另外一个野生型的B-Raf和C-Raf蛋白分子。在正常细胞中，Ras确实也能通过B-Raf：C-Raf异源二聚体进行信号转导。携带Ras癌基因突变的黑色素瘤患者，用此药治疗后能强烈激活Ras-Raf-MEK-MAPK信号通路。MEK是Raf蛋白的直接下游激酶，阻断MEK活性的药物通常能阻止该药物出现相反疗效。如下图所示：①正常细胞中，具有丝裂原活性的GTP型Ras蛋白结合并激活B-Raf/C-Raf异源二聚体，并由B-raf强烈激活下游信号通路，这导致MEK和MAPK/ERK激活。②在