药品微生物限度检查方法学验证试验

药品微生物限度检查方法学验证试验10/12/20220第二节

微生物限度检查中计数方法的验证

10/12/20221细菌计数验证用菌株(营养琼脂培养基)：大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌。霉菌、酵母菌计数验证用菌株〔玫瑰红钠琼脂培养基、YPD琼脂〕：白色念珠菌、黑曲霉。加菌量:50～100cfu。〔菌液制备和计数见后〕验证用菌株10/12/20222计数方法的验证

验证时，按供试液的制备和细菌、霉菌及酵母菌计数所规定的方法，对各试验菌的回收率应逐一进行验证。验证试验至少应进行3次独立的平行试验，并分别计算各试验菌每次试验的回收率。10/12/20223根据样品特性，制订检验方法和检验条件。保证验证试验所用的仪器、培养基和试剂等均符合要求。按制订的方法进行验证试验。根据验证结果，判断是否符合设立的验证标准要求。假设符合，按验证的方法和条件进行药品的微生物限度检查；假设不符合，应重新设立验证方案，再进行验证，直至验证结果符合设立的验证标准。10/12/20224计数方法的验证验证方法选择：平皿法或薄膜过滤法操作环境和仪器菌液的制备：存期供试品的处理样品稀释级的选择：最低稀释级培养基：营养琼脂、玫瑰红钠琼脂、YPD琼脂10/12/20225计数方法的验证

1.试验组2.菌液组3.稀释剂对照组4.供试品对照组每一验证菌株均应进行上述试验。10/12/20226试验组药+菌

平皿法：取试验可能用的最低稀释级供试液1ml和50～100cfu试验菌，分别注入平皿中，立即倾注琼脂培养基，每株试验菌平行制备2个平皿，按平皿法测定其菌落数。药+菌薄膜过滤法：取规定量试验可能用的最低稀释级供试液，过滤，冲洗，应在最后一次的冲洗液中加入50～100cfu试验菌，过滤，按薄膜过滤法测定其菌数。10/12/2022710/12/2022810/12/20229稀释剂对照组假设供试液制备需要分散、乳化，中和、离心或薄膜过滤等特殊处理时，应增加稀释剂对照组，以考察供试液制备过程中微生物受影响的程度。试验时，可用相应的稀释液替代供试品，加入试验菌，使最终菌浓度为每1ml供试液含50～100cfu，按试验组的供试液制备方法和菌落计数方法测定其菌数。

10/12/202210

菌液组测定所加的试验菌数。薄膜过滤法菌液组？供试品对照组取规定量供试液，按菌落计数方法测定供试品本底菌数。10/12/202211计数方法的验证-结果判断指标规定：各试验菌的回收率，包括试验组和稀释剂对照组的回收率均不得低于70%。试验组回收率：试验组菌数-供试品对照组菌数

菌液组菌数稀释剂对照组回收率：稀释剂对照组菌数

菌液组菌数10/12/202212回收率测定举例〔如金黄色葡萄球菌〕常规法-供试液不用特殊制备方法试验组：最低稀释级供试液1ml+1ml菌液2个平皿菌液组：1ml菌液2个平皿供试品对照组：最低稀释级供试液1ml2个平皿培养基稀释法-5个平皿试验组：最低稀释级供试液0.2ml+1ml菌液5个平皿*2组菌液组：1ml菌液2个平皿供试品对照组：最低稀释级供试液0.2ml5个平皿*2组各平皿倾入营养琼脂培养基。10/12/202213回收率测定举例〔如金黄色葡萄球菌〕供试液需用特殊制备方法〔离心沉淀法〕试验组：最低稀释级供试液离心沉淀处理后取1ml+1ml菌液2个平皿菌液组：1ml菌液2个平皿供试品对照组：最低稀释级供试液离心沉淀处理后取1ml2个平皿稀释剂对照组：〔稀释剂+适量菌液〕离心沉淀处理后取1ml2个平皿各平皿倾入营养琼脂培养基。10/12/202214回收率测定举例〔如金黄色葡萄球菌〕供试液需用特殊制备方法〔薄膜过滤法〕试验组：含1g或1ml的供试液过滤冲洗+1ml菌液过滤至少1个平皿.菌液组：1ml菌液2个平皿供试品对照组：含1g或1ml的供试液过滤冲洗至少1个平皿稀释剂对照组：冲洗量稀释剂过滤，最后的冲洗液中+1ml菌液过滤至少1个平皿各膜贴在营养琼脂培养基平皿。10/12/202215计数方法的确定细菌计数方法与霉菌和酵母菌计数方法可以不一致。以各试验菌的回收率均能达到70%以上的检测方法为准。

10/12/202216控制菌检查法的验证试验菌株：按规定检查的控制菌选择相应验证的菌株。加菌量:10～100cfu。10/12/202217控制菌检查法验证的方法验证试验按供试液的制备和控制菌检查法的规定要求进行。验证试验可与供试品的控制菌检查同时进行。验证方法：取规定量供试液及10～100cfu试验菌加入增菌培养基中，依相应控制菌检查法进行检查。当采用薄膜过滤法时，取规定量供试液，过滤，冲洗，试验菌应加在最后一次冲洗液中，过滤后，注入培养基〔封闭式滤器〕或取出滤膜接入增菌培养基中。10/12/202218控制菌检查法的验证-结果判断假设上述试验检出试验菌，按此供试液制备法和控制菌检查法进行供试品的该控制菌检查。假设未检出试验菌，应采用稀释法、低速离心沉淀、薄膜过滤法、中和法等方法或联合使用这些方法消除供试品的抑菌活性，并重新验证。10/12/202219

大肠埃希菌检查

供试品→供试液

↓

不少于100ml的胆盐乳糖增菌液

↓18~24h/48h取0.2ml↓5mlMUG培养基中

↓5、24h366nm紫外光下观察↓加靛基质试剂┌────────────┐MUG阳性，靛基质阳性MUG阴性，靛基质阳性MUG阴性，靛基质阴性MUG阳性，靛基质阴性↓↓取胆盐乳糖培养液划线报告曙红亚甲蓝琼脂平板或麦康凯琼脂平板↓18~24h

┌────────────┐

阳性阴性↓↓镜检、适宜的生化试验报告报告10/12/20222010/12/20222110/12/202222

铜绿假单胞菌检验

供试品

↓

供试液

↓

不少于100ml的BL增菌液↓18~24h溴化十六烷三甲铵平板↓18~24h典型或疑似菌落营养琼脂斜面↓18~24h氧化酶、革兰染色镜检┌────────────┐

氧化酶阴性

氧化酶阳性非革兰阴性无芽孢杆菌革兰阴性无芽孢杆菌

↓

↓报告阴性

绿脓菌素

┌────────────┐

绿脓菌素阳性

绿脓菌素阴性

↓

↓

报告适宜的生化试验

↓

报告10/12/202223沙门菌检验供试品10g/10ml

↓不少于200ml的营养肉汤↓18~24h

取1ml

↓四硫磺酸钠亮绿增菌液10ml

↓18~24h

DHL,EMB,MacC

↓18~24h

┌────────────┐无典型菌落三糖铁琼脂〔TSI)↓↓18~24h报告阴性┌────────┐斜面未见红色〔黄色〕其他底层未见黄色〔黑色〕

↓↓报告阴性血清凝集、适宜的生化试验10/12/202224大肠菌群检查程序和0.001g)1ml供试液

↓

10ml乳糖胆盐发酵管

↓18~24h┌────────────┐不产酸、不产气产酸、产气↓↓大肠菌群阴性曙红亚甲蓝琼脂平板↓或麦康凯琼脂平板报告↓18~24h

┌────────────┐

无典型菌落革兰阴性无芽孢杆菌↓↓报告乳糖发酵管

↓18~24h

┌─────────┐产酸产气不产酸产气↓↓大肠菌群阳性大肠菌群阴性↓↓报告报告10/12/202225可能的大肠菌群数表

各供试品量的检出结果最可能的大肠菌群数N（个/g或ml）0.1g或0.1ml

0.01g或0.01ml

0.001g或0.001ml

+++＞103++-102

＜N＜103+--10＜N＜102---＜1010/12/202226

金黄色葡萄球菌检验程序供试品

↓

供试液

↓

不少于100ml的亚碲酸钠肉汤(营养肉汤〕

↓18~24h

卵黄氯化钠平板或甘露醇氯化钠平板

↓24~72h

┌────────────┐无菌落或无典型菌落营养琼脂斜面↓↓18~24h报告血浆凝固酶试验，革兰染色镜检

10/12/202227梭菌的检验程序供试品→供试液10ml(相当于供试品1g、1ml)〔两份〕

1份↓80℃10min迅速冷却两份↓↓100ml梭菌增菌培养基↓厌氧48h

↓涂抹含庆大霉素的哥伦比亚琼脂平板35~37℃厌氧48~72h┌──────────┐有菌落生长无菌落生长↓↓过氧化氢酶试验，镜检报告┌──────────┐过氧化氢酶阴性，革兰阳性梭菌非左述反应报告检出报告未检出10/12/202228白色念珠菌检验程序供试品

↓

供试液

↓

不少于100ml的沙氏葡萄糖

↓48~72h

沙氏葡萄糖平板

↓24~48h

┌────────────┐无菌落或无典型菌落念珠菌显色培养基

↓报告未检出↓24~48h

┌──────────┐

1%聚山梨酯玉米琼脂无翠绿色或绿色菌落

↓24~48h

↓┌────────────┐

报告未检出染色，镜检及芽管试验

┌────────────┐

非革兰氏阳性菌，显微镜下未见厚膜孢子、假菌丝、芽管报告未检出10/12/202229药品微生物限度检查法验证试验结果不符合要求时可采用的其他处理方法中和法培养基稀释法薄膜过滤法离心沉淀法联合方法10/12/202230药品微生物限度检查法验证例如10/12/202231银翘解毒片-金黄色葡萄球菌(常规法)试验次数供试品浓度回收率%试验组稀释剂对照组11:1092.59