实验三、鸡胚细胞的原代培养(改进)课件

实验三、鸡胚细胞的原代培养为什么要进行细胞培养高等生物是由多细胞构成的整体，在整体条件下要研究单个细胞或某一群细胞在体内（in

vivo）的功能活动是十分困难的。如果把活细胞拿到体外（in

vitro）培养进行观察和研究，则要方便得多。高等动植物细胞要求的生存条件极其严格，稍有不适就要死亡。所以细胞培养技术（cell

culture）就是选用最佳生存条件对活细胞进行培养和研究的技术。细胞培养的优点1.便于应用物理、化学、生物等外界因素探索和揭示细胞生命活动的规律；2.便于应用各种不同技术方法研究和观察细胞结构和功能的变化；3.可以长期研究和观察细胞遗传行为的改变；4.可以提供大量生物性状相同的细胞作为研究对象。原代培养

（primary

culture）：从动物机体取出的进行培养的细胞群。原代培养的细胞生长比较缓慢，而且繁殖一定的代数后（一般10代以内）停止生长，需要重新更换培养基。将细胞从一个培养瓶转移到另外一个培养瓶即称为传代或传代培养（Passage）。

原代培养的概念培养方式组织培养细胞培养器官培养培养基

培养基（培养液）是维持体外细胞生存和生长的溶液，分天然培养基和合成培养基。（一）天然培养基：类型：有血清、血浆、和组织提取液（如鸡胚和牛胚浸液）。优点：营养成分丰富，培养效果好缺点：1.来源受限。

2.成分复杂，影响对某些实验产物的提取和实验结果的分析。3.易发生支原体污染

（二）合成培养基概念：是根据细胞生存所需物质的种类和数量，用人工方法模拟合成的。目前使用的合成培养基有TC199、MEM、RPMI-1640、DMEM等。主要成分:

氨基酸、维生素、碳水化合物、无机盐和其它一些辅助物质。优点:

标准化生产，组分和含量相对固定，成本低。缺点:

缺少某些成分，不能完全满足体外细胞生长需要；人工合成培养基只能维持细胞生存，要想使细胞生长和繁殖，还需补充一定量的天然培养基(如血清)。合成培养基中血清的加入量：一般说来．含5％小牛血清的培养基对大多数细胞可以维持细胞不死．但支持细胞生长一般需加10％血清。血清质量好坏是实验成败的关键。常用血清类型：有胎牛血清、新生牛血清、小牛血清、兔血清、马血清等，其中以胎牛血清质量最好。优质血清的标准：透明，淡黄色，无沉淀物，无细菌、支原体、病毒污染。血清的灭活（消除补体活性）：56℃，30分钟。血清的消毒：过滤除菌。无血清培养液中补加物具有独特性：适用于某种细胞株的培养液，很可能不适合另一种细胞株的生长。即使同源组织的不同细胞株，所需补加物也不同。

无血清培养基的目前使用情况：尚处于研究阶段，难以推广。目前，绝大多数人工合成培养基使用时还需添加血清

完全培养基的组成基础培养基80％一95％血清5％一20％碳酸氢钠2.0g/L青、链霉素各100单位／毫升培养基的配制

RPMI-1640培养粉1袋碳酸氢钠2.0g

青、链霉素各100单位/毫升加三蒸水至1000ml,过滤除菌。调节pH值至7.2，加血清至终浓度为10％。

原代培养的过程取材——培养材料的制备——接种——加培养液—培养1.取材1）准备工作：A.解剖取材器具、用品的清洗、包装、灭菌

B.工作台面、工作环境的消毒

C.操作者本人的消毒：肥皂水刷手，0.2%新洁尔灭浸泡前臂或者用酒精擦拭消毒，穿工作衣，戴帽、口罩D.对实验动物消毒2.取材和培养材料的制备A.切取合适大小的组织块或者器官，在平衡盐溶液或者培养液中洗涤，除去血污，剔除脂肪、被膜结缔组织以及坏死的组织。可滴加培养液或者平衡盐溶液来保持湿润；B.将组织块放置于盛有培养液的培养皿中，剪碎，（接种），组织碎块和培养液一起移到离心管中，吸去上清液；血球计数板计数法原理

利用血球计数板在显微镜下直接计数，是一种常用的细胞计数方法。此法的优点是直观、快速。将经过适当稀释的细胞悬液放在血球计数板载玻片与盖玻片之间的计数室中，在显微镜下进行计数。由于计数室的容积是一定的，所以可以根据在显微镜下观察到的细胞数目来换算成单位体积内细胞总数目。3.接种与培养A.植块培养定义：——将组织切割成一定大小的植块，接种到培养器皿中，加入培养液进行培养。目的：——观察植块的组织学生长行为，使植块细胞迁移并在植块外分裂增殖，取出植块后得到细胞培养物。植块培养接种方法1.用湿润的吸管将植块小心吸取并轻轻吹出到培养瓶中，按照一定的形式或者间隔将植块排列好；2.加入培养基，倒转培养一天；3.待植块贴壁后，再倒转培养瓶，使植块浸没在培养液中，继续培养；4.观察细胞生长情况，按照生长情况更换培养液。C悬浮细胞培养

某些白血病细胞、腹水瘤细胞等。对培养基不断搅拌或者对培养器皿进行振荡、旋转而维持细胞的悬浮状态。原代培养的注意事项1.培养液按照细胞生长情况，选择最适合的培养液；摸索需要补加的成分及添加量；培养体系的酸碱度；适当换液。2.培养空间培养液体与液体上方的空间的体积比为1:10为宜。液体的高度最好维持在2-5mm；用品器材

1.超净工作台内：污物缸1个、酒精灯2个、酒精棉球1瓶、大镊子1把、打火机1个、5毫升移液器,1640培养基30毫升(方瓶，2人共用）、

Hank’s液20毫升（圆瓶，2人共用）；

2.饭盒1个,枪头4支,操作照egg,画气室线.egg消毒,台面消毒;戴无菌袖套.点燃酒精灯，手部消毒。将egg置于蛋座（气室朝上），外表再次消毒。中镊敲碎蛋壳，沿气室线剥开。Hank’s液→培养皿A，B。(大镊子夹瓶塞，用吸管吸取)小镊撕内膜，挑出鸡胚→

A清洗,剪去头,肝,腿,翅等。6.将材料转入B再次清洗;A换Hank’s，材料再于A中漂洗;8.剪取1/5~1/3的组织,转入小烧杯(10ml)，剪成0.5~1mm3碎块。将碎块倒入三角锥瓶,用1ml胰酶清洗小烧杯,合入锥瓶,迅速摇匀;10.锥瓶加塞,覆口,拿出工作台,于37℃水浴锅中消化5~7分钟(严格)!,中间摇动2~3次;于超净工作台中加入4~5ml培养基,终止消化.用吸管充分吹打7~8次;将细胞悬液用纱布过滤,进入20ml烧杯(凹面!)用培养基清洗纱布2次,每次3~4ml;分别取2ml,2ml和3ml细胞悬液接种至三只培养瓶中(3ml在塑料瓶),补加培养