RT-PCR试剂盒说明书

RT-PCR试剂盒说明书公司：TIANGENOrder:。Toll-free:800-990-6057/400-810-6057TIANGENBIOTECH(BEIJING)CO.,LTD版本号：KR121221TIANScriptRTKitTIANScriptcDNA第一链合成试剂盒目录号：KR104产品内容:产品组成KR104-0125rxnKR104-02100rxnTIANScriptM-MLV(200U/口l)25口l100口lOligo(dT)15(10口M)60口l240口lRandom(10口M)60口l240口l5XFirst-StrandBuffer150口l500口lRNase-FreeddH2O1ml2X1mlSuperPuredNTPsmMeach)60口l240口lRNasin(40U/口l)15口l2X30口l储存条件： -20C保存。产品介绍：TIANScriptRTKit (cDNA第一链合成试剂盒)是专为两步法 RT-PCR第一步实验配制的，具有高灵敏度的RT-PCR反应系统，可以从极低量的总 RNA或poly(A)+RNA合成第一链cDNA与PCR反应相结合，可用于检测稀有基因的表达、从极少量细胞中定量检测特定mRNA勺表达水平、克隆特定基因的 cDNA片段等。产品特点：合理配备了与cDNA第一链合成反应相关的各种组分，该试剂盒中的TIANScriptM-MLV具有高效的逆转录酶活性，对后续的PCR或定量PCF实验兼容性好，适合于各种PCF耐热聚合酶。注意事项：用于cDNA合成反应的溶液试剂尽量可能用 DEPC进行处理，并在高压灭菌后使用。有些试剂不能高压灭菌时，首先用经过灭菌的器具、水等配制溶液后，再将溶液进行过滤除菌处理。RNA样品要避免基因组DNA污染避免多次反复冻融RNA使RNA保持在冰浴中处融化状态。试剂盒的各组成成分应在-20C保存。cDNA产物应置于-20C保存。操作步骤：在冰浴的无核酸酶的离心管中加入如下反应混合物：1-5(1g总RNA或50-500ngmRNA;211oligo(dT) 15或211Random或2pmol基因特异引物；211SuperPuredNTPsmMeach);补RNase-FreeddH20定容至11。70C加热5min后迅速在冰上冷却 2min。简短离心收集反应液后加入以下各组分：4 115xFirst-StrandBuffer(含有DTT)； 1lRNasin。力口1il(200U)TIANScriptM-MLV，轻轻用移液器混匀。如果用随机引物，请将离心管置25C温浴10min。42C温浴50min。95C加热5min终止反应，置冰上进行后续实验或冰冻保存。如果需要RNaseH处理，进行步骤6。否则，进行步骤7。力口RNaseH11l(2U),37C温浴20min以降解RNA然后95C加热5min使酶失活。用RNase-FreeddH2O将反应体系稀释到50il，取2-5il进行PCR扩增反应。PCF反应：应吸取10%的第一链反应液(2il)进行PCR反应；即使加入更多量的第一链反应液也不能增加其扩增的产物量，反而可能会抑制正常的 PCR反应。1.请将以下成分加入到一PCR管中并使其终反应体积为50il:组成成分体积10xPCRBuffer511TaqDNApolymerase(5U/1l)1110mMdNTPsmix1 1150mMMgCl211扩增引物1(101M)1 11扩增引物2(101M)1 11cDNA(第一链反应)2 11

ddH2O