Rubisco及其活化酶抗体的制备及其在作物中的应用

Rubisco及其活化酶抗体的制备及其在作物中的应用研究生：陈相辉学号：01143 指导老师：王忠教授（扬州大学农学院农学系，扬州225009）Rubisco（1,5-二磷酸核酮糖羧化酶/加氧酶，ribulose-1,5-bisphosphatecarboxylase/oxygenase）是光合碳代谢中的关键酶，处于光合碳还原和光合碳氧化这两个方向相反但又相互连锁的循环的交叉点上，调节着光合作用和光呼吸的代谢比例，其活性大小对光合速率起着决定性作用。1、 选题依据Rubisco和Rubisco活化酶的特性一直是光合作用研究的热点问题，如何提高作物中这两种酶的含量和活性也一直是个悬而未解决的难题。目前，国内外多以烟草、菠菜作为研究Rubisco和Rubisco活化酶的材料，涉及小麦和水稻等作物方面的内容较少，尤其有关小麦Rubisco活化酶的研究仍然是国内外研究中的空白。2、 研究目的和意义本试验拟用小麦为研究对象，研究Rubisco及其活化酶的酶学特性和调节机制。在研究方法上，酶的分离和提纯方法采用最新技术，并有所改进；而在含量测定上，将免疫学技术与植物生理生化技术相结合，采用抗体抗原特异性反应的原理来测定，这也为免疫学在植物上的进一步应用奠定了基础。在研究内容上，不仅研究自然生长状态下，Rubisco及其活化酶的含量和活性，而且设置多重处理，研究不同处理条件下和C3、C4植株体内Rubisco，Rubisco活化酶含量、活性的变化，并结合光合速率、ATP、RuBP含量、叶绿素含量的测定，探讨它们之间的内在相关性。本实验创新之处是利用免疫化学技术提供一个快速、准确而简易的定量测定Rubisco和Rubisco活化酶的方法，从而可以预测光合潜力和估计由于矿质营养、水分供给、光照、植物生长调节素和基因调控发生变化而引起光合作用和产量的变化。进一步对Rubisco和Rubisco活化酶做深入的研究。3、 研究内容3.1、 Rubisco和Rubisco活化酶的提取和纯化3.2、 Rubisco和Rubisco活化酶抗体的制备3.3、 Rubisco和Rubisco活化酶ELISA标准曲线的制定3.4、 C3、C4植物中Rubisco和Rubisco活化酶含量比较及其与光合作用的关系3.5、 光暗处理对小麦光合作用及Rubisco、Rubisco活化酶的影响3.6、 不同施氮水平对小麦光合速率和Rubisco、Rubisco活化酶的影响3.7、 Rubisco和Rubisco活化酶单克隆抗体制备初探4、材料和方法注射器JTTOC\o"1-5"\h\z4.1材料 与％,1.1.1植物材料 二、、扬麦5号(’liiiicumaestivumL.CV.Yangmi :.5),田间自然生长，苗期叶片用于酶的提纯，后期旗叶用于光合速率、Rubisco活性和含量的测 " '定。 图1新西兰大白兔4.1.2动物材料健康的新西兰大白兔，体重2〜3公斤，首先免疫三联苗(兔瘟、巴氏杆菌病、魏氏梭菌病)，一周后进行试验。4.2试剂与仪器液相层析收集系统,Bio-Rad垂直板电泳系统，高速冷冻离心机,Gene-System紫外分光光度计；SephadexG-25,DEAE-纤维素(DEAE-TOYOPEARL-650M,日本)，PMSF,Benzamidine，Freund氏完全和不完全佐剂，ATP，Leupetine，HEPES，DTT，已纯化且具有活性的Rubisco为本实验室保存。Rubisco活化酶的纯化取100g新鲜小麦叶片，放入液氮中速冻10min，取出后先在碾钵中碾碎，再加入2g不溶性PVP和少量石英砂以及300mLRubisco活化酶提取液(50mmol/LHEPES-KOHPH7.0,1mmol/LEDTA,5mmol/LMgCl2,0.4mmol/LATP,15mmol/LDTT,1mmol/LPMSF,2mmol/LBenzamidine,0.01mmol/LLeupeptin)。将混合物在0°C下捣碎15~20min，匀浆后用4层纱布过滤，30000g离心45min，上清液用饱和(NH4)2SO4(pH7.0)盐析，取20%~35%的蛋白质段，沉淀用5mL含35%饱和(NH4)2SO4的缓冲液(20mmol/LHEPES-KOHpH7.0,0.4mmol/LATP,10mmol/LDTT,100mmol/LKCl)悬浮，10000g离心10min后，沉淀用3mL不含(NH4)2SO4的缓冲液溶解，离心，经SephadexG-25(1.5X20cm)脱盐，用缓冲液平衡和洗脱，收集到的蛋白质峰在液N2中过夜。次日，沉淀溶解后20000g离心10min，上清液经DEAE-纤维素(DEAE-TOYOPEARL-650M)阴离子交换柱(1.5X20cm)，先用25mL洗脱液(20mmol/LHEPES-KOHpH7.0,4mmol/LDTT)洗脱，然后用60mL含0~0.5mol/LKCl的洗脱液梯度洗脱。洗脱速度为1mL/min，每1mL收集一管，蛋白质峰进行活性和纯度鉴定。得到的蛋白质峰加ATP至1mmol/L，经SDS检验酶纯度后，用于酶特性分析。其余酶液先用液氮保存，后转入-70C低温冰箱中，用作制备Rubisco活化酶抗体。为了减少酶的失活，纯化过程均在4C下进行。Rubisco活化酶的SDS分析配置12%分离胶，3.2%浓缩胶，将20pl样品与4pl的6倍上样缓冲液混合煮沸3min，自然冷却后，上样。在120V、40mA条件下恒压电泳2.5h。电泳结束后用含2%考马斯亮兰(G250)染色液染色30min，7.5%冰醋酸和5%的甲醇脱

色液过夜脱色。Rubisco活化酶抗体的制备按Sambrood[50]等皮下多位点分数次注射法免疫大白兔。第一次免疫将0.5mL抗原与0.5mLFreund氏完全佐剂充分混合制成油包水乳剂，皮下注射于每只兔子背部多个部位，每个部位0.20〜0.25mL,4〜5点。半个月之后，进行第二次免疫，方法同第一次，只是将Freund氏完全佐剂换成Freund氏不完全佐剂即可。以后每隔两周进行一次皮下多点注射免疫，方法与第二次完全一样。三免后可从耳缘静脉采血，检测抗血清滴度，如满足实验要求，则通过心脏采血，全血以10000rpm离心1min，后放置于4°C冰箱中过夜，次日吸取其上清即可用于实验。如滴度太低不满足需要，则可继续以第二次免疫方法进行加强免疫。Rubisco抗体的制备方法类同于活化酶抗体的制备，只是将抗原换成Rubisco即可。4.7蛋白质含量的测定用紫外分光光度法，分别测定260nm、280nm吸光度。以OD280X1.45-OD260X0.74计算出蛋白质浓度（mg・mL-1）。4.8ELISA法测定酶含加KubiMo抗慷JiUKubiscofA体加酵标第二抗体加磋物抗血加KubiMo抗慷JiUKubiscofA体加酵标第二抗体加磋物抗血igg 血3房珈抗体Ruhjsco抗体与 酶促底物成附于裁体表新与抗原结合 酵标策二抗体站肖显色反应用一系列已知浓度的标准抗原（Rubisco和Rubisco活化酶）与制备的Rubisco和Rubisco活化酶的抗体反应，制成一条标准曲线，再将待测样品与原的含量。之相比较，求得样品中抗图2之相比较，求得样品中抗图2ELISA法实验原理4.9蛋白质含量的测定依Folin-酚试剂法（薛应龙，1985）测定，以BSA作标准曲线。4.10光合速率和叶绿素含量的测定采用美国CID公司的CID31OPC便携式光合速率测定仪测光合速率；用日本产SPAD型叶绿素计测定，用绿色程度表示剑叶叶绿素的相对含量。5、实验进展提取和纯化了Rubisco和Rubisco活化酶。6、研究计划6.1、 Rubisco和Rubisco活化酶抗体的制备6.2、 Rubisc