9基因工程抗体和抗体工程

第五五节节抗抗体体工工程程抗体体研研究究进进展展3个个阶阶段段：：①1890年年白白喉喉抗抗毒毒素素，，多多克克隆隆抗抗体体；；②1975年年杂杂交交瘤瘤技技术术单单克克隆隆抗抗体体；；③1994年年基基因因工工程程抗抗体体；；Cgenescodefortheconstantregionsofimmunoglobulinproteinchains.Vgeneissequencecodingforthemajorpartofthevariable(N-terminal)regionofanimmunoglobulinchain.ImmunoglobulingenesareassembledfromtheirpartsinlymphocytesFigure24.4Heavyandlightchainscombinetogenerateanimmunoglobulinwithseveraldiscretedomains.ImmunoglobulingenesareassembledfromtheirpartsinlymphocytesFigure24.4Heavyandlightchainscombinetogenerateanimmunoglobulinwithseveraldiscretedomains.ImmunoglobulingenesareassembledfromtheirpartsinlymphocytesTable24.1EachimmunoglobulinfamilyconsistsofaclusterofVgeneslinkedtoitsCgene(s).ImmunoglobulingenesareassembledfromtheirpartsinlymphocytesFamilyVGenesCGenesManMouseManMouseLambda<3002>64Kappa<300~100011Heavy~300>100098Figure24.5ThelambdaCgenesegmentisprecededbyaJsegment,sothatV-Jrecombinationgeneratesafunctionallambdalight-chaingene.ImmunoglobulingenesareassembledfromtheirpartsinlymphocytesFigure24.6ThekappaCgenesegmentisprecededbymultipleJsegmentsinthegermline.V-JjoiningmayrecognizeanyoneoftheJsegments,whichisthensplicedtotheCgenesegmentduringRNAprocessing.ImmunoglobulingenesareassembledfromtheirpartsinlymphocytesFigure24.7Heavygenesareassembledbysequentialjoiningreactions.FirstaDsegmentisjoinedtoaJsegment;thenaVgenesegmentisjoinedtotheDsegment.ImmunoglobulingenesareassembledfromtheirpartsinlymphocytesFigure24.8ThelambdafamilyconsistsofVgenesegmentslinkedtoasmallnumberofJ-Cgenesegments.ThediversityofgermlineinformationFigure24.9ThehumanandmousekappafamiliesconsistofVgenesegmentslinkedto5JsegmentsconnectedtoasingleCgenesegment.ThediversityofgermlineinformationFigure24.10Asinglegeneclusterinmancontainsalltheinformationforheavy-chaingeneassembly.ThediversityofgermlineinformationFigure24.12Consensussequencesarepresentininvertedorientationateachpairofrecombiningsites.Onememberofeachpairhasaspacingof12bpbetweenitscomponents;theotherhas23bpspacing.RecombinationbetweenVandCgenesegmentsgeneratesdeletionsandrearrangementsFigure24.13Breakageandreunionatconsensussequencesgeneratesimmunoglobulingenes.RecombinationbetweenVandCgenesegmentsgeneratesdeletionsandrearrangementsFigure15.8Reciprocalrecombinationbetweendirectrepeatsexcisesthematerialbetweenthem;eachproductofrecombinationhasonecopyofthedirectrepeat.RecombinationbetweenVandCgenesegmentsgeneratesdeletionsandrearrangementsFigure15.9Reciprocalrecombinationbetweeninvertedrepeatsinvertstheregionbetweenthem.一、噬菌体抗抗体库技术的的

基本方法法⒈获取目的基基因⒉抗体库技术术的载体⒊淘筛⒋表达与鉴定定它是在PCR技术和PhageDisplay的基础上上实现的。其其过程是把用用PCR法得得到的抗体基基因插入丝状状噬菌体的DNA，与噬噬菌体外壳蛋蛋白的基因相相连，在辅助助噬菌体的帮帮助下，噬菌菌粒包装成丝丝状噬菌体，，抗体分子通通过与PⅢⅢ或PⅧ相连连，在噬菌体体表面的一端端或分散分布布，然后可直直接对噬菌体体表面的抗体体分子进行筛筛选。噬菌体抗体库库技术1990年McCafferty等成功地建建立了噬菌体体表面展示系系统，通过将将抗溶菌酶单单链抗体基因因克隆于fd噬菌体基因因3的下游，，使ScFv以融合蛋白白的形式展示示于噬菌体表表面，利用亲亲和层析，两两轮富集达106倍。该技术的的成功给抗体体基因的筛选选工作带来了了革命性的变变革。噬菌体表面展展示系统(phagesurfacedisplaysystem)噬菌体表面展展示文库技术术的要点:外源基因表达达多肽以融合合蛋白形式展展示在外壳蛋蛋白N端将基因组合文文库插入噬菌菌体编码膜蛋蛋白的基因g3或g8的先导系系列的紧靠下下游随机克隆入相相应载体形成成组合文库从免疫或未被被免疫的B细细胞中PCR扩增抗体全全套基因片段段用固相化抗原原经“亲和结结合一洗脱一一扩增”数个个循环直接、、方便、简捷捷、高效地筛筛选出表达特特异性好、亲亲和力强的抗抗体噬菌体库库。使翻译出的抗抗体分泌到细细菌的质周腔腔内，形成游游离的抗体片片段，经过纯纯化即可获得得目的抗体。。筛选到的噬菌菌体再将基因因g3或g8切除后，转转入大肠杆菌菌，该项技术的优优点:将抗体的基因型型和表型紧密密联系起来;可绕过杂交瘤瘤技术，不需需要复杂的基基因工程技术术;抗体基因筛选选的范围广;技术稳定、可可靠、生产周周期短;可规规模化生产;适用范围广，，既可用于抗抗体制备，也也适用于其它它蛋白如激素素、酶、药物物、随机多肽肽等的生产。。噬菌体抗体库库技术的发展展具有很大优优越性。它简简单易行，筛筛选容量大，，效率高，绕绕过了细胞融融合及免疫等等步骤，而且且在表型一基基因型的统一一和识别一增增殖过程上模模拟了B细胞胞的成熟过程程，从而在实实际应用上具具有很大意义义。二、噬菌体抗抗体库技术的的

特点⒈模拟天然全全套抗体库⒉避开了人工工免疫和杂交交瘤技术⒊可获得高亲亲和力的人源源化抗体单克隆抗体噬噬菌体抗体杂杂交交瘤技术展展示技术宿主细胞:杂杂交瘤细细菌筛选范围:~103107109时间:几几个个月几几周周操作:繁繁杂相相对简单免疫:必必须可可避免人源抗体:+费用:高高低低生产量:有有限无无限基因获取:再再克隆直直接接应用前景:有有限限不不可估三、基因工程程抗体表达⒈原核细胞表表达⒉真核细胞表表达⒊转基因植物物表达⒋转基因动物物表达第六节抗抗体诊断试剂剂一、血清学鉴鉴定用的抗体体类试剂⒈鉴定病原菌菌的抗体试剂剂⑴常用诊断血血清的品种和和用途①沙门氏菌属属诊断血清②志贺氏菌属属诊断血清③病原性大肠肠埃希氏菌诊诊断血清⑵诊断断血清清的制制备步步骤①制备备细菌菌抗原原②免疫疫动物物和制制备抗抗体血血清⑶诊断断血清清诊断断方法法⒉乙型型肝炎炎病毒毒表面面抗原原的反向被被动血血凝诊诊断试试剂⒊妊娠娠诊断断试剂剂⒋抗ABO血型型系统统血清清二、免免疫标标记技技术用用的抗抗体类类试试剂⒈荧光光抗体体诊断断试剂剂⑴荧光光抗体体的制制备⑵免疫疫荧光光测定定方法法⒉免疫疫酶抗抗体诊诊断试试剂⑴免疫疫酶染染色法法用抗抗体诊诊断试试剂⑵酶免免疫测测定用用抗体体诊断断试剂剂①HBsAg酶酶标诊诊断试试剂②HBeAg酶酶标诊诊断试试剂③HAVAg（（甲型型肝炎炎病毒毒抗原原）酶标诊诊断试试剂④测定定HIV（（人免免疫缺缺陷病病毒））抗原的酶酶标抗抗体诊诊断试试剂⑤甲胎胎蛋白白（AFP）酶酶标抗抗体诊诊断试剂剂⑥癌胚胚抗原原（CEA）的的酶标标抗体体诊断试试剂⒊放射射免疫疫用抗抗体诊诊断试试剂放射免免疫技技术是是将放放射性性核素素分析析的高高度灵灵敏性性与抗抗原抗抗体反反应的的特异异性结结合起起来建建立的的检测测技术术。放射性性核素素标记记抗体体的方方法：：①氯胺胺-T法②Iodogen氏氏法抗原的的测定定有：：①夹心心法②间接接法③竟争争法3.竞竞争法法Ag※Ag※Ab+AbAg(标本本)(定定量)AgAbEE终止液液标本本酶标标抗抗体体底物物显色色显色色固相相固相相标本本酶标标二二抗抗底物物1.夹夹心心法法2.间间接接法法①HBsAg放放射射性性核核素素标标记记抗抗体体诊断断试试剂剂②HBeAg放放射射性性核核素素标标记记抗抗体体诊断断试试剂剂③HAV抗抗原原放放射射性性核核素素标标记记抗抗体体诊断断试试剂剂④AFP放放射射性性核核素素标标记记抗抗体体诊断断试试剂剂⑤CEA放放射射性性核核素素标标记记抗抗体体诊断断试试剂剂常用用标标记记抗抗体体试试剂剂有有：：三、、导导向向诊诊断断药药物物放射射性性核核素素标标记记抗抗体体肿瘤瘤放放射射免免疫疫显显像像放射射免免疫疫显显像像优优点点：：①在在体体内内确确切切肿肿瘤瘤定定位位作作用用，，准准确确性性达达90%，，灵灵敏敏度度达达100%。。②在在体体内内可可检检出出0.5cm大大小小的的病病灶灶，，并并可可检检出出肺肺脑脑的的转转移移灶灶。。③小小分分子子抗抗体体易易到到达达肿肿瘤瘤部部位位，，可显显著著提提高高N/NT值值。。④抗抗体体在在肿肿瘤瘤部部位位可可保保留留6～～9日日⑤能观观擦擦抗抗体体在在血血中中的的半半衰衰期期和和可能能出出现现的的不不良良反反应应。。放射射免免疫疫显显像像定定位位技技术术将抗抗肿肿瘤瘤单单克克隆隆抗抗体体（（Ab））与与二二乙乙基基三三胺胺五五乙乙酸酸（（DTPA））在在体体外外偶偶联联成成Ab-DTPA，，再再注注入入体体内内后后，，就就能能与与体体内内组组织织相相结结合合。。由由于于抗抗体体分分子子量量大大，，需需3天天完完成成。。3天天后后注注入入放放射射性性核核素素In-113M（（半半衰衰期期100m）），，因因DTPA是是重重金金属属离离子子络络合合剂剂，，所所以以In-113M可可以以结结合合到到DTPA分分子子上上，，使使肿肿瘤瘤组组织织显显像像。。这这一一过过程程在在2小小时时内内可可完完成成。。建立立预预定定位位技技术术需需解解决决3个个问问题题：：①抗抗体体在在肿肿瘤瘤组组织织滞滞留留要要7天天以以上上。。②②Ab-DTPA偶偶联联物物比比较较稳稳定定；；③内内源源性性金金属属离离子子对对DTPA的的封封闭闭作用用要要小小。。第六节抗抗体体治疗药药物以抗体为为载体的的导向治治疗药物物，还不不成熟。。一、放射射性核素素标记的的抗体治治疗药物物抗体作为为放射性性核素的的导向载载体，标标记操作作简便用用量小。。放射性性核素标标记的抗抗体对肿肿瘤细胞胞杀伤较较大。二、抗癌癌药物偶偶联的抗抗体药物物⒈常用的的抗癌药药物氨甲喋呤呤（MTX）、、阿霉素素（ADM）、、丝裂霉霉素（MMC））等。以以人血浆浆白蛋白白作为中中间载体体，可明明显提高高每分子子抗体所所携带的的MTX量，使使体外细细胞毒性性体高二二倍。⒉抗体类类药物逆逆转耐药药性肿瘤细胞胞对抗原原药物可可产生多多药耐药药性（MDR））。MDR是是由基因因调控的的，其编编码蛋白白称为P糖蛋白白，其中中P170是与与肿瘤耐耐药相关关的主要要蛋白，，由Mdr1基基因编码码，1280氨氨基酸残残基，分分子量170K。认为P蛋蛋白是ATP酶酶依赖性性药泵，，药物进进入细胞胞后与P蛋白结结合，利利用ATP水解解释放的的能量将将药物泵泵出胞外外，使胞胞内药物物蓄积减减少，因因而