抗生素类药物的鉴别与测定课件

第十六章抗生素类药物的分析第一节概述一、抗生素药物的特点（一）抗生素是指“在低微浓度下即可对某些生物的生命活动有特异抑制作用的化学物质的总称”。多数由微生物发酵、经化学纯化、精制和化学修饰，制成适当制剂

与合成药物相比：结构、组成复杂

1、化学纯度低——三多（1）、同系物多——庆大霉素含四个主要组分（2）、异构体多——半合成β-内酰胺类抗生素均存在光学异构体（3）、降解物多——四环素类存在脱水、差向异构体

2、活性组分易发生变异——微生物菌株、发酵条件的改变均导致产品质量发生变化(组分的组成或比例)3、稳定性差——通常含活泼基团，基团往往是活性中心（青霉素中的β-内酰胺环）（一）、鉴别试验鉴别试验——理化为主要方法1、官能团的显色反应

β-内酰胺环——羟肟酸铁反应链霉素——麦芽酚反应等抗生素盐类——通常鉴别酸根或金属离子或有机碱

2、光谱法——IR法和UV法（多晶）3、色谱法——TLC和HPLC法(对照品对照法)4、生物学法——灭菌前后的抑菌能力（与已知含量的标准品对照）（二）、检查

1、影响产品稳定性的指标——结晶性、酸碱度、水分或干燥失重

2、控制有机和无机杂质的指标——溶液的澄清度与颜色、有关物质、残留溶剂、炽灼残渣、重金属等

3、与临床安全性密切相关的指标—异常毒性、热源或细菌内毒素、降压物质、无菌等

4、其它指标（1）、多组分——组分分析（硫酸庆大霉素C组分的测定）（2）、悬浮时间与抽针试验（3）、聚合物（4）、杂质吸收度

测定方法——管碟法和浊度法管碟法——抗生素在摊布特定试验菌的固体培养基内呈球面形扩散，形成含一定浓度抗生素球形区,抑制了试验菌的繁殖而呈现出透明的抑菌圈通过比较标准品与供试品产生抑菌圈的大小来测定供试品的效价优点——灵敏度高、需用量小，测定结果较直观；测定原理与临床应用的要求一致，更能确定抗生素的医疗价值；适用范围广——较纯的精制品、纯度较差的制品、已知的或新发现的抗生素均能应用；

2、理化方法——根据分子结构特点，利用其特有的化学或物理化学性质及反应而进行对于提纯的产品以及化学结构已确定的抗生素——较迅速、准确地测定其效价，并具有较高的专属性

化学方法——运用结构上官能团的特殊化学反应（含有具同样官能团就不适用，或需采取适当方法加以校正如果利用某一类型抗生素的共同结构部分的反应——测得的结果代表总的含量，并不一定能代表抗生素的生物效价。

理化方法测定必须与生物效价吻合目前各国药典所收载的理化方法—HPLC法，如-内酰胺类、四环类、大环内酯类大多采用HPLC法测含量

3、活性——效价单位表示指每毫升或每毫克中含有某种抗生素的有效成分的多少.用单位(u)或微克（g）表示。一种抗生素有一个效价基准，同一种抗生素的各种盐类的效价可根据其分子量与标准盐类进行换算。

如1毫克青霉素G钠盐定为1667单位；

1mg青霉素G钾盐的单位（u）=1667×356.4/372.5=1595u/mg。理论效价（实际样品往往低于理论效价）

三、抗生素的分类（二）、根据化学结构分类——局限于化学结构明确的抗生素β-内酰胺类、氨基苷类、四环素类、大环内酯类、多烯大环类、多肽类、苯烃胺类、蒽环类其他抗生素（不属于上述类型）第二节β-内酰胺类抗生素一、化学结构与性质（一）化学结构青霉素和头孢菌素的母核1、游离羧基和酰胺侧链2、氢化噻唑环或氢化噻嗪环与β-内酰胺并合的杂环青霉素族——侧链RCO-与母核6-APA结合；三个手性C原子C2、C5、C6头孢菌素族——侧链RCO-与母核7-ACA组成；含两个手性C原子C6、C7

酰胺基上R以及R1的不同，构成各种不同的青霉素和头孢菌素表16－1P.411（2）旋光性——青霉素族含三个手性碳原子，头孢菌素族含两个手性碳原子（定性和定量）

（3）紫外吸收特性头孢菌素族母核——具有O＝C－N－C＝C结构R取代基——苯环等共轭系统青霉素族母核——无共轭系统侧链酰胺基上R取代基——苯环等共轭系统（4）β－内酰胺环的不稳定性β-内酰胺环——活性中心，性质活泼，最不稳定部分稳定性——含水量和纯度有关干燥——较稳定，室温条件下密封保存，贮存3年以上水溶液——很不稳定，随pH和温度而有很大变化青霉素降解反应头孢噻吩降解反应二、鉴别试验（一）呈色反应1、羟肟酸铁反应——碱性中与羟胺作用，β-内酰胺环破裂生成羟肟酸；在稀酸中与高铁离子呈色。

羟肟酸铁反应式2、类似肽键的反应(茚三酮反应)具有-CONH-结构(取代基有α－氨基酸)——显双缩脲和茚三酮反应头孢氨苄,头孢羟氨苄，头孢拉定，头孢克洛侧链均为氨苄基，中国药典采用TLC鉴别、检查时,以茚三酮为显色剂

3、其它呈色反应（1）、侧链含有-C6H5-OH——与重氮苯磺酸试液产生偶合（2）、可与变色酸-硫酸、硫酸-硝酸、铜盐等试剂反应（二）各种盐的反应许多制成钾盐或钠盐供临床使用—钾、钠离子的火焰反应（三）、光谱法1、红外吸收光谱（IR）IR——反映分子的结构特征，各国药典收载的β-内酰胺类抗生素几乎均采用了本法进行鉴别

2、紫外分光光度法（UV）（1）λmax——供试品配成适当浓度的溶液，直接测定UV光谱，根据λmax或λmin处的吸收度鉴定（2）水解产物的最大吸收波长—供试品在一定条件下水解，测定水解产物的λmax（四）、色谱法

HPLC和TLC——各国药典广泛用于鉴别试验HPLC——供试品与对照品主峰的保留时间（tR）（在含量测定项下的色谱图中）TLC——供试品与对照品斑点的保留值（Rf）是否一致三、特殊杂质的检查

主要有高分子聚合物，有关物质，异构体等HPLC法——主成分自身对照法或对照品对照法UV法——测定杂质的吸收度有效性试验—结晶性、吸碘物质、抽针与悬浮时间（一）、聚合物

主要——反相高效液相色谱，凝胶色谱和离子交换色谱凝胶色谱的分离原理——利用分子筛作用，药物分子自由地进入凝胶颗粒内部，高分子杂质被排阻，不能进入颗粒内部

高分子杂质定量测定法1、主成分自身对照法——用于高分子杂质含量较低的品种。2、面积归一法3、限量法——用于混合物中高分子物质的控制。通常规定不得检出保留时间小于对照品保留时间的组分。4、自身对照外标法——按外标法计算（二）、有关物质和异构体

通常采用色谱法——自身对照法或对照品对照法

（三）、吸收度（两个波长处测A）Amax——控制主药含量

Aλ——控制杂质的量四、含量测定

各国药典大多采用理化测定方法主要讨论中国药典收载的方法，如高效液相色谱法、碘量法、电位络合滴定法、可见-紫外分光光度法等

（一）、HPLC法较好地分离可能存在的降解产物、未除尽的原料及中间体等杂质而准确定量——适用于原料、各种制剂及生物样本的分析测定

第三节氨基糖苷类抗生素

氨基苷类抗生素——碱性环已多元醇为苷元，与氨基缩合而成的苷主要——链霉素、庆大霉素、卡那霉素、新霉素及巴龙霉素、硫酸奈替米星、硫酸西索米星、硫酸依替米星等

一、化学结构与性质（一）、化学结构链霉素——一分子链霉胍和一分子链霉双糖胺结合而成的碱性苷链霉双糖胺——链霉糖与N-甲基L-葡萄糖胺所组成链霉胍与链霉双糖胺间的苷键结合较弱，链霉糖与N-甲基-L-葡萄糖胺间的苷键结合较牢

链霉素

庆大霉素——是由绛红糖胺、脱氧链霉胺和加洛糖胺缩合而成的苷它是庆大霉素C复合物,主要组分为C1、C2、C1a及C2a,尚有少量次要成分(如庆大霉素A1、A2、A3、A4、B、B1、X……)

庆大霉素主要组分C1、C2、C1a及C2a的结构

庆大霉素R1R2R3分子式C1CH3CH3HC21H43N5O7

C2CH3HHC20H41N5O7C1aHHHC19H29N5O7C2aHHCH3C20H41N5O7（二）、性质（1）、溶解度与碱性含有多个羟基和碱性基团—碱性、水溶性抗生素，能与矿酸或有机酸成盐，临床上应用的主要为硫酸盐硫酸盐易溶于水，不溶于乙醇、氯仿、乙醚等有机溶剂

（2）、旋光性含有多个氨基糖——具有旋光性（3）、苷的水解与稳定性含有二糖胺结构氨基葡萄糖与链霉糖或D-核糖之间的苷键较强链霉胍与链霉双糖胺（苷元与二糖胺）间的苷键结合较弱

酸性条件下链霉素水解：链霉胍和链霉双糖胺进一步水解：N-甲基-L-葡萄糖胺碱性条件下链霉素水解：链霉胍及链霉双糖胺并使链霉糖部分发生分子重排，生成麦芽酚（maltol）,（链霉素特有,用于鉴别和定量）（4）、紫外吸收链霉素在230nm处有紫外吸收庆大霉素、奈替米星等无UV吸收

二、鉴别试验

（一）、茚三酮反应

氨基糖苷结构，具有羟基胺类和α-氨基酸的性质，与茚三酮缩合成蓝紫色化合物

（二）、Molisch试验具五碳糖或六碳糖结构的，经酸性水解，在盐酸（或硫酸）作用下脱水生成糠醛（五碳糖）或羟甲基糠醛（六碳糖）——这些产物遇-萘酚或蒽酮显色

1、-萘酚显色原理——自学

2、蒽酮的显色原理——自学

（三）、N-甲基葡萄糖胺反应

水解产物葡萄糖胺衍生物，在碱性溶液中与乙酰丙酮缩合成吡咯衍生物

（I），再与对二甲氨基苯甲醛的酸性醇溶液（Ehrlich试剂）反应,生成樱桃红色缩合物（II）

（四）、麦芽酚（Maltol）反应—链霉素的特征反应碱性溶液中，链霉糖经分子重排使环扩大形成六元环，然后消除N-甲基葡萄糖胺，再消除链霉胍生成麦芽酚，麦芽酚可与铁离子在微酸性溶液中形成紫红色配位化合物

反应原理

（五）、坂口（Sakaguchi）反应—水解产物链霉胍的特有反应碱水解产物链霉胍和8-羟基喹啉（或α-萘酚）分别同次溴酸钠反应,其各自产物再相互作用生成橙红色化合物

反应原理（六）、硫酸盐反应本类多为硫酸盐，各国药典都将硫酸根的鉴定作为鉴别这类抗生素

（七）、色谱法

1、薄层色谱法薄层板——硅胶展开剂——氯仿-甲醇-浓氨水显色剂——茚三酮或碘蒸气

2、高效液相色谱法BP——用HPLC法鉴别庆大霉素

比较供试液和标准品溶液的色谱图,庆大霉素C1、C2、C1a及C2a四组分的保留时间应一致

（八）、光谱法1、红外光谱法2、紫外分光光度法庆大霉素分子中无共轭双键系统，故在紫外区无吸收（BP）三、特殊杂质检查及组分分析（一）、链霉素中链霉素B的检查链霉素B（活性低）——发酵中由菌种产生的，能被甘露糖链霉素B苷酶水解成甘露糖和链霉素提取、精制不彻底，可能残存活性较低的链霉素B（二）、庆大霉素C组分测定发酵工艺基本一致，提炼工艺各有特点。由于发酵菌种不同或工艺略有差别，各厂产品C组分含量比例不完全一致庆大霉素C1、C2、C1a对微生物的活性无明显差异，但其毒副作用和耐药性有差异，各组分的多少影响产品的效价和临床疗效药典——以标准曲线法（标准品对照）C1—25~50％C1a－15~40％C2＋C2a－20~50％（四）、硫酸盐测定——自学临床应用主要为硫酸盐，各国药典规定EDTA络合滴定法测定硫酸盐含量

四、含量测定

效价测定——各国药典主要采用微生物检定法。但其理化分析方法近年来国内外发表的论文很多

微生物法、色谱法是本类抗生素的定量分析的主要方法

第四节四环素类抗生素

一、化学结构与性质（一）、化学结构四骈苯或萘骈萘的衍生物基本结构（二）、性质1、酸碱性与溶解度

C4－二甲氨基——弱碱性；

C10－ph-OH和两个含有酮基和烯醇基的共轭双键系统——弱酸性四环素类——两性化合物；遇酸及碱生成相应的盐，临床多盐酸盐

结晶性物质——具引湿性盐酸盐——易溶于水，并溶于碱或酸性溶液中，而不溶于氯仿、乙醚等有机溶剂四环类抗生素的游离碱——在水中的溶解度很小，溶解度与溶液的pH值有关

2、旋光性具不对称碳原子,用于定性、定量

3、紫外吸收和荧光性质含共轭双键，在紫外光区有吸收4、稳定性对各种氧化剂、酸、碱都不稳定的干燥的四环类游离碱及其盐类避光条件下保存均较稳定，水溶液随pH的不同会发生差向异构化、降解等反应，尤其是碱性水溶液特别容易氧化，颜色很快变深，形成色素

（1）、差向异构化性质（一）

弱酸性（pH2.0~6.0）溶液中会发生差向异构化A环上手性碳原子C4构型的改变，发生差向异构化，形成差向四环素类（ETC），其抗菌性能极弱或完全消失

（1）、差向异构化性质四环类的差向异构化反应

（2）降解性质A、酸性降解在酸性条件下（pH﹤2），特别是在加热情况下，四环类抗生素C6上的醇羟基和C5a上的氢发生反式消去反应生成脱水四环素(ATC)

(比色)脱水四环素形成差向异构体——差向脱水四环素（EATC）反应式

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