2、《饲料添加剂中甘露寡糖的测定》 编制说明

四川省地方标准DB51/Txxxx-xxxx饲料添加剂中甘露寡糖的测定Determinationofmannanoligosaccharidesinfeedadditive—（送审稿）编制说明主要完成单位：四川省饲料工作总站《饲料添加剂中甘露寡糖的测定》编制说明（送审稿）标准制定背景及任务来源甘露寡糖又称为甘露低聚糖，是从酵母培养细胞壁中提取的一类新型抗原活性物质，典型机构见图1。由于它不仅具有低热、稳定、安全无毒等良好的理化性质，还具有保护肠道和提高免疫力等作用，国外已将其作为饲料添加剂广泛用于饲料工业。甘露寡糖广泛存在于魔芋粉、瓜儿豆胶、田菁胶及多种微生物细胞壁内，目前商品用甘露寡糖主要通过酶解法进行生产，是从富含葡甘露寡糖(MOS)的酵母细胞壁中通过发酵法提取出来的葡甘露聚糖蛋白复合体。其中甘露寡糖主要为二、三和四糖等的混合物。它作为饲料添加剂应用于动物生产中时，可以增强动物的免疫能力，降低胃肠道疾病的发生率和死亡率，还能提高动物的日增重和饲料转化率，因此具有极大的发展潜力。甘露寡糖具有一定的免疫原性，能够刺激机体免疫应答，而且它能与一定的毒素、病毒和真菌细胞的表面结合而作为这些外源抗原的佐剂(Adjuvants)，减缓抗原的吸收，增加抗原的效价，从而增强动物体的细胞和体液免疫反应，也可通过刺激肝脏分泌甘露糖结合蛋白而影响免疫系统，这种蛋白质能与细菌夹膜相粘接并触发一连串的补体，从而启动免疫系统产生应答反应。Kim等(2000)报道，甘露寡糖和β-葡聚糖均能加快仔猪已经抑制了的免疫系统的恢复，并能有效的减少死亡率和降低腹泻率。研究发现，甘露寡糖能使肉鸡胆汁中lgA水平提高14.2％(Savvage等，1996a)，也可提高火鸡肠粘膜中lgA的水平，并显著提高火鸡血液中IgG的含量(Savvage等，1996b)。Spring(1998)研究发现，甘露寡糖能够显著提高无菌仔猪血清与肠粘膜中lgA、lgG和lgM的含量及血液中自细胞介素-2(IL-2)的水平，增强T淋巴细胞功能和小肠原始淋巴细胞的活性，增强小肠内白细胞的吞噬能力和促进激活的淋巴细胞释放IFY-γ细胞素，后者可促使巨噬细胞、体液及蛋白质移向感染部位，以及激活感染部位的巨噬细胞杀死吞噬的病原菌；对普通仔猪，甘露寡糖只是显著提高了其血清lgA水平，而对lgG、lgM没有明显影响。甘露寡糖能够显著提高哺乳仔猪PHA-淋巴细胞转化率和吞噬细胞的吞噬能力(spring等，1997，1998；Ocarrca，1998；邵良平等，2000a)；显著提高鸡白细胞吞噬能力和PHA淋巴细胞转化率，有效改善鸡肠道微生物环境并显著减低大肠杆菌数和盲肠、回肠内容物的pH值，并极显著地提高鸡血清中超氧化物歧化酶(SOD)和谷胱甘肽过氧化物酶(GPx)的活性(邵良平，2000b)。大量研究表明，甘露寡糖作为饲料添加剂应用于动物生产时，能激活动物的免疫反应，提高肉鸡、火鸡、断奶仔猪及犊牛的日增重和饲料转化率，降低胃肠道疾病的发生率和死亡率。Vander(1997)和Dvorak(1998)试验证实，甘露寡糖能提高仔猪日增重和饲料转化率，其原因可能是其提高了仔猪的免疫力，抑制了病原菌在胃肠道的增殖。Newman等(1993，1995)和Dilday等(1997)报道，甘露寡糖也能显著提高犊牛的日增重，降低发病率。综上所述，建立准确检测甘露寡糖的检测方法能够精准指导生产，稳定的检测方法非常必要。本标准的制定任务来源于四川省市场监督管理局，文件编号为川市监函[2020]560号，任务名称为《饲料添加剂中甘露寡糖的测定》。本标准的技术归口单位是四川省农业农村厅，主要起草单位是四川省饲料工作总站。参考国内外相关检测方法，结合试验结果起草本标准。图1.甘露寡糖的典型结构二、标准编制原则及主要工作内容（一）标准编制主要原则本标准的编写制定过程中以优化测试方法的选择性、准确度、精密度、检测限和分析效率为总原则，反映科学技术的先进成果和先进经验。使用性能的普遍性包括方法精密度、准确度、检测限等方面能满足要求，确保标准既能保持技术上的先进性，又具有经济上合理性。同时遵循了标准制定过程中的先进性、经济性和适用性原则。在标准的制定过程中严格遵循国家有关方针、政策、法规和规章，标准的编写规则及表述按照《标准化工作导则第1部分：标准化文件的结构和起草规则》（GB/T1.1-2020）和《标准编制规则第4部分：试验方法标准》（GB/T20001.4-2015）要求编写，并参照了GB/T27404-2008和GB/T27417和GB/T23182-2008标准要求和编写格式。在标准制定过程中力求做到：技术内容的叙述正确无误；文字表达准确、简明、易懂；标准的构成严谨合理；内容编排、层次划分等符合逻辑与规定。（二）主要工作内容接到标准制定任务后，组织实验室相关人员对工作细节进行分解安排，于2020年9-12月在国内外文献库，查阅相关产品中甘露寡糖测定的有关标准和资料，初步制定了实验方案。2021年1月～2021年5月，初步拟定高效液相色谱仪的色谱条件、前处理条件、比较不同条件下对样品提取、净化和分离条件的优化效果。2021年6月～2021年7月，根据拟定的优化方案，按方法步骤逐一进行条件优化。2021年8月，色谱条件、前处理条件基本确定，为提高方法的稳定性，又对方法中涉及的细节：如标准物质储备液、内标的稳定性和保存期进行了测试分析，逐步确定了方法细节。2021年9月，对方法性能包括方法适用性、线性范围、准确度、精确度、定量限、检测限和稳健度等性能指标进行了考察，形成了方法征求意见稿。2022年1月，对标准征求意见稿广泛征求相关单位多位专家意见，并对意见进行汇总，对标准文本和编制说明进行修改，形成标准预审稿。2022年3月，四川省农药检定所、农业农村部农产品加工质量安全监督检验中心（北京）、四川威尔检测技术股份有限公司3家单位对标准征求意见稿进行了方法的验证。三、主要技术内容确定的依据和试验验证的分析（一）方法的建立1.分析方法确定根据文献汇总分析后初步确定的检测方法，进行了提取条件和糖柱分离的色谱条件的优化。线性范围通过标准曲线拟合判断。标准曲线则使用标准贮备溶液稀释的系列标准工作溶液，设置5个点进行测定。本方法采取甘露寡糖水解成甘露糖来进行定量甘露寡糖的含量，关于甘露寡糖是否可以完全转化为甘露糖的问题：一、甘露寡糖主要为二、三和四糖等的混合物，从结构上或者是原理上来说，可以实现完全的转化，二、通过甘露四糖标准品的实验，证明甘露四糖可以完全转化。三、从行业方来说，甘露寡糖的品质也是由甘露糖来评定的，统一的尺子可以到达衡量产品质量优劣的作用。在制定方法定量限时，根据《化学分析方法验证确认和内部质量控制实施指南》（GB/T35655-2017）、《合格评定化学分析方法确认和验证指南》（GB/T27417-2017）和《饲料中兽药及其他化学物检测试验规程》（GB/T23182-2008），检测限（LOD）和定量限（LOQ）的考察先通过3倍信噪比和10倍信噪比初步计算出检测限和定量限的可能值，然后通过实际添加回收结果确定LOQ，以回收率结果和相对标准偏差符合要求的最低样品添加浓度为LOQ值。然后按LOQ的一半进行计算LOD。准确度和精密度采用低、中、高共3个添加浓度进行测定，分析各添加浓度条件下甘露寡糖的添加回收率结果和变异系数。添加浓度的回收率范围应该在70~120%之间，结果的变异系数应在20%以内。2、优化前处理条件2.1色谱条件的确定2.1.1色谱柱的确定液相色谱具有分离速度快、灵敏度高等特点，从标准共同使用和重复使用的基本要求，本实验选用灵敏度中等的Waters公司e2695进行方法开发和验证，在方法研制过程中，我们选用BIO-RADAminexHPX-87P（7.8×300mm）色谱柱和WatersSugar-PakTM1（6.5×300mm）色谱柱进行比较，发现两家公司的色谱柱峰型都很好，AminexHPX-8此色谱柱上甘露糖保留时间相对较早，但价格较贵。Waters的色谱柱无论是保留时间还是分离度也都可以满足要求，本标准选用AminexHPX-87P（7.8×300mm）色谱柱进行样品的分离检测。色谱图见图2。图2甘露糖标准溶液色谱图2.1.2流动相的确定流动相：AminexHPX-87P色谱柱的树脂离子型为铅型，基质为磺化聚苯乙烯二乙烯苯，推荐的流动相为水。pH使用范围为5-9。在室温环境下，对于已加热的Aminex糖柱操作流速不能高于0.3ml/min。首先，维持较低的流速的同时加热柱温箱，然后当柱温达到推荐温度后开始提升操作流速。Sugar-PakTM1此色谱柱由钙基树脂填装而成,氢离子或其它离子会取代钙离子,或是引起与柱中糖的置换,尤其是像蔗糖这样易于置换的糖.因此推荐在流动相中加入一定量的钙离子来保持平衡和防止与样品的置换，流动相使用水或者EDTA钙盐溶液（50mg/L）。流速：Sugar-PakTM1和AminexHPX-87P色谱柱最大流速均不应超过0.6ml/min，一般情况下在柱温达到70℃时,流速才增至0.6mL/min，Waters公司e2695的柱温箱最高温度为65℃，考虑标准方法的通用性和检测的效率等，流速设为0.5mL/min，柱温设为60℃。2.1.3标准溶液稳定性考察对标准储备液的稳定性进行考察。将2mg/mL标准储备液分成若干份置于-20℃储存，分别在配制当天、储存1个月、2个月和3个月后用水稀释至200μg/mL，液相测定，重复进样6次，取峰面积的平均值观察重复性，以RSD≤5%结果有效。结果如图3所示，甘露糖的标准储备液于-20℃下储存，在3个月内稳定，无明显降解和变化。本文件将标准贮备液的有效期定为3个月。图3.甘露糖标准储备液稳定性2.1.4样品的前处理根据甘露寡糖的理化特性，本方法参考了文献和生产企业的企业标准中有关甘露寡糖前处理的方法，对水解时间45min、60min和75min进行了比较，结果表明，水解60min时目标物峰形和回收率均较好，具体结果见图4。最终前处理过程确定为：称取试样1g于10mL的具塞离心管中，加入6.0mL盐酸，放置30℃水浴中水解45min，期间涡旋振荡2次。将提取液全部转入100mL带刻度的试剂瓶中，用60mL水分3次洗涤离心管，洗涤液并入试剂瓶中，盖上试剂瓶盖。移至高压灭菌锅中，于121℃下水解理60min，取出冷却至室温，用氢氧化钠溶液调节溶液pH值至6～7，转入100mL容量瓶中，加水定容，混匀，经0.45μm微孔滤膜过滤，用高效液相色谱仪测定。图4优化水解时间与平均回收率情况采用实际样品比较了采用“加入6.0mL盐酸后放置30℃水浴中水解45min”和不通过“放置30℃水浴中水解45min”直接移至高压灭菌锅中，于121℃下水解理60min。具体结果见表1，由表1结果可以看出，采用了“放置30℃水浴中水解45min”的结果明显比不经过“放置30℃水浴中水解45min”要高，特别是对于混合型饲料添加剂影响比较大。再增加工作量不大的情况下，本标准采用“加入6.0mL盐酸后放置30℃水浴中水解45min”。表1前处理二步水解与一步水解比较结果情况样品编号样品名称经30℃水浴结果未30℃水浴结果备注1饲料添加剂22.3%20.2%经30℃水浴优2饲料添加剂22.9%21.5%经30℃水浴优3饲料添加剂22.7%21.8%经30℃水浴优4混合型饲料添加剂12.6g/kg10.5g/kg经30℃水浴优5混合型饲料添加剂12.7g/kg10.2g/kg经30℃水浴优6混合型饲料添加剂12.9g/kg11.7g/kg经30℃水浴优2.1.5干扰试验考察在糖柱条件下，其他类似糖分析方法的干扰。根据酵母细胞壁其他产物与甘露寡糖用途和性质，我们选择葡萄糖和半乳糖其作用类似物进行干扰试验。在甘露糖的液相条件下，葡萄糖、半乳糖与甘露糖保留时间不一致，分离度达到要求。由此表明，葡萄糖和半乳糖对甘露糖的检测没有干扰。干扰试验的液相色谱图见图5。图5.甘露糖干扰试验图谱2.2方法学考察2.2.1线性精确移取适量标准储备液，用水稀释，制得浓度分别为10μg/mL、50μg/mL、200μg/mL、500μg/mL和1000μg/mL的标准系列溶液（临用现配），由低浓度到高浓度供高效液相色谱仪测定。以色谱峰面积为纵坐标，浓度为横坐标，绘制标准曲线。线性关系大于0.999，线性良好，见图6。图6.甘露糖标准曲线2.2.2方法的灵敏度空白试样（载体沸石粉）按相同步骤处理后，测定结果表明，在相应的保留时间处，空白试料对所测药物无干扰。检测限（LOD）：添加1mg标准溶液（甘露四糖）于1g空白添加剂预混合饲料（载体蒙脱石）中，经提取后测定，依据信噪比S/N≥3（按峰对峰计），考虑不同厂家不同型号仪器的灵敏度差异，扩大标准方法的适用范围，在添加剂预混合饲料中的检测限为1000mg/kg。定量限（LOQ）：添加2mg标准溶液（甘露四糖）于1g空白添加剂预混合饲料（载体蒙脱石）中，依据信噪比S/N≥10（按峰对峰计），考虑不同厂家不同型号仪器的灵敏度差异，扩大标准方法的适用范围，在添加剂预混合饲料中的定量限为2000mg/kg。2.2.3方法的准确度和精密度考察本方法采用饲料添加剂实际样品中添加甘露四糖，考察了甘露寡糖在饲料添加剂中的添加回收情况；采用标准添加法考察了甘露寡糖在添加剂预混合饲料中的添加回收情况。结合甘露寡糖的使用量，在空白饲料中载体沸石粉、载体蒙脱石及实际样品中添加3个不同水平2.0g/kg、10g/kg、200g/kg的甘露寡糖进行准确度和精密度试验，各浓度进行5个样品平行试验，重复3次，求批内、批间相对标准偏差，添加浓度的回收率范围在80.1~106.5%之间，结果的变异系数小于8.6%。计算结果见表2~5。表2饲料添加剂中甘露寡糖添加回收率试验结果添加浓度测定批次回收率（%）平均回收率批内RSD批间RSD（%）12345（%）（%）（%）5Ⅰ89.188.789.295.395.391.53.85.7Ⅱ85.292.189.293.388.289.63.6Ⅲ99.693.286.899.8103.296.56.810Ⅰ95.386.395.095.894.293.34.34.8Ⅱ93.197.290.697.194.394.53.0Ⅲ82.797.893.189.299.192.47.220Ⅰ85.492.295.390.285.889.84.75.5Ⅱ89.392.392.593.694.592.42.1Ⅲ91.5104.386.597.798.195.67.1表3混合型饲料添加剂中甘露寡糖添加回收率试验结果（蒙脱石）添加浓度测定批次回收率（%）平均回收率批内RSD批间RSD（g/kg）12345（%）（%）（%）2Ⅰ89.588.483.99585.188.44.93.9Ⅱ87.892.386.589.193.989.93.4Ⅲ94.393.589.389.186.190.53.820Ⅰ92.1102.391.8105.193.196.96.57.4Ⅱ103.587.597.198.784.894.38.4Ⅲ92.9107.0100.186.389.595.28.8200Ⅰ95.592.696.1100.889.794.94.44.7Ⅱ95.7101.3102.898.3104.2100.53.4Ⅲ101.790.6100.397.5103.698.75.1表4混合型饲料添加剂中甘露寡糖添加回收率试验结果（沸石粉）添加浓度测定批次回收率（%）平均回收率批内RSD批间RSD（g/kg）12345（%）（%）（%）2Ⅰ96.699.793.5103.495.497.74.05.0Ⅱ103.192.389.597.1101.496.76.0Ⅲ99.1103.599.3103.289.899.05.620Ⅰ95.6107.1101.895.396.799.35.16.1Ⅱ93.887.9103.193.194.194.45.8Ⅲ102.987.790.796.489.793.56.6200Ⅰ95.1102.3105.190.789.496.57.26.4Ⅱ90.191.592.881.394.290.05.7Ⅲ91.597.387.397.198.194.35.0表5混合型饲料添加剂中甘露寡糖添加回收率试验结果（实际样品）添加浓度测定批次回收率（%）平均回收率批内RSD批间RSD（g/kg）12345（%）（%）（%）2Ⅰ106.598.493.1105.495.299.76.08.5Ⅱ92.899.496.789.588.393.35.0Ⅲ82.186.288.380.185.484.43..920Ⅰ92.492.5101.795.5103.497.15.34.1Ⅱ103.4105.3104.598.3101.5102.62.7Ⅲ102.9102.1100.1102.3102.7102.01.1200Ⅰ105.392.696.1100.889.196.86.66.7Ⅱ90.591.882.7101.594.792.27.4Ⅲ88.190.890.887.7101.391.76.0（注：实际样品的回收率计算时扣除实际样品中的含量。）2.3实际样品检测根据所建立的检测方法对市售不同规格的添加剂预混合饲料进行甘露寡糖的检测，共计21份，具体结果见表6。经检测发现一份添加剂预混合饲料的甘露寡糖未检出，质控的回收率符合实验要求。表6实际样品中甘露寡糖检测结果情况编号名称标示量检测结果备注Y1甘露寡糖（添加剂）20%22.1%合格Y2甘露寡糖（添加剂）20%21.8%合格Y3甘露寡糖（添加剂）20%22.5%合格Y4甘露寡糖（添加剂）5%5.6%合格Y5甘露寡糖（添加剂）5%6.2%合格Y6甘露寡糖（添加剂）5%5.8%合格Y7甘露寡糖（添加剂）10%11.3%合格Y8甘露寡糖（添加剂）10%12.5%合格Y9甘露寡糖（添加剂）40%43.1%合格Y10甘露寡糖（添加剂）40%42.8%合格Y11甘露寡糖（混合型）30g/kg35.8g/kg合格Y12甘露寡糖（混合型）30g/kg36.1g/kg合格Y13甘露寡糖（混合型）30g/kg33.5g/kg合格Y14甘露寡糖（混合型）30g/kg未检出不合格Y15甘露寡糖（混合型）50g/kg52.6g/kg合格Y16甘露寡糖（混合型）50g/kg51.5g/kg合格Y17甘露寡糖（混合型）10g/kg11.8g/kg合格Y18甘露寡糖（混合型）10g/kg12.3g/kg合格Y19甘露寡糖（混合型）0.5%0.57%合格Y20甘露寡糖（混合型）0.5%0.62%合格Y21甘露寡糖（混合型）10g/kg12.5g/kg合格2.4方法验证情况方法经中国农业科学院农产品加工研究所、四川省农药检定所和四川威尔检测技术股份有限公司3家单位进行了实验室间的方法验证，对方法进行了空白饲料基质在3个浓度添加水平上的回收试验，三个单位进行了复核试验，以进行本方法的准确度和重复性验证。复核实验结果显示：该标准方法的标准曲线相关系数可达0.999，回收率范围在69.3%～110.7%之间，相对标准偏差（RSD）均小于10.9％，方法检出限、定量限可满足本方法要求，该方法通过验证。四、与国际、国外同类标准技术内容的对比情况本标准为化学分析方法标准，与国际、国外同类标准技术内容基本一致，并不涉及有关国家安全、保护人体健康和人身财产安全、环境质量要求等有关强制性地方标准或强制性条文等的八项要求之一，建议将其作为推荐性标准颁布实施。五、采标情