生物化学 实验八、九 组织核酸含量化学测定

实验八、九组织核酸含量化学测定

XiamenUniversity生物化学实验2016年04月07日厦门1868年瑞士科学家米歇尔(F.Miescher)发现细胞核内含高量磷的酸性物质，命名为核素(后改名为核酸)早期的研究仅将核酸看成是细胞中的一般化学成分，没有人注意到它在生物体内有什么功能；核酸的发现F.Miescher核酸作为遗传物质的发现过程20世纪初，德国生理学家柯塞尔(Kossel)证实了核酸是由四种不同的碱基所组成；美国科学家列文(Levene)又确定了核酸有两种,即DNA和RNA；1928英国科学家格里菲斯(Griffith)利用细菌的性状转变实验，证明了遗传信息的可传递性；1944美国科学家艾佛瑞(Avery)证实了DNA造成细菌性状转变的物质基础；1952美国科学家赫雪(Heishey)和蔡斯(Chase)证明遗传物质是DNA非蛋白质；1953年，英国科学家沃森和克里克发现了DNA的双螺旋结构；核酸是一类生物高分子化合物，存在于一切生物体内，是组成细胞的重要成分。它以与蛋白质结合的形式--核蛋白存在于细胞中，是生命的基本物质之一，具有储存、复制生物体遗传信息的功能，也是蛋白质合成不可缺少的物质，因此它对于生物体的生长、遗传、变异等现象起着重要的决定作用核酸分为两大类--核糖核酸(RNA)和脱氧核糖核酸(DNA)

核酸完全水解产生嘌呤和嘧啶等碱性物质、戊糖(核糖或脱氧核糖)和磷酸的混合物核酸部分水解则产生核苷和核苷酸。每个核苷分子含一分子碱基和一分子戊糖，一分子核苷酸部分水解后除产生核苷外，还有一分子磷酸核酸的各种水解产物可用层析或电泳等方法分离鉴定核酸nucleicacid核苷酸nucleotide核苷nucleoside磷酸phosphate嘌呤碱purinebase

或嘧啶碱pyrimidinebase(碱基base)核糖ribose

或脱氧核糖deoxyribose

(戊糖amylsugar)DNA和RNA的分子结构每个核苷酸都含有一个磷酸根，因此可通过测定磷含量来推算核酸的含量。通常DNA含磷量约为9.84%，RNA含磷量约为9.5%，根据所测磷量可计算DNA和RNA的含量。组成核酸的戊糖有两种。DNA所含的糖为β-D-2-脱氧核糖；RNA所含的糖则为β-D-核糖。RiboseDeoxyribose核酸的化学性质核酸可被碱水解产物核苷酸和脱氧核苷酸核苷酸可进一步被浓硫酸水解产物：碱基、核糖和磷酸核酸定量测定常见的方法1.定磷法：将核酸消化，测定其无机磷量，由此计算出核酸含量，反应灵敏。2.紫外吸收法：利用核酸在260nm处有吸收高峰，操作简便，受蛋白质和核苷酸的干扰影响。3.地衣酚(苔黑酚)法：用于测定RNA的含量，RNA与浓盐酸共热，降解形成的核糖转变为糠醛，利用地衣酚(3,5二羟甲苯)反应来测定，特异性差，戊糖均有此反应。4.二苯胺法：DNA中的脱氧核糖在酸性溶液中转化为ω-羟-γ-酮基戊醛，利用二苯胺试剂反应，除脱氧木糖和阿拉伯糖外其他糖类无此反应。定磷法的原理

首先将核酸样品用硫酸消化成无机磷，利用定磷试剂测定无机磷量。反应式为：(NH4)MoO4+H2SO4H2MoO4+(NH4)2SO4H3PO4+12H2MoO4H3P(Mo3O10)4+12H2O

H3P(Mo3O10)4Mo2O3•

MoO3(钼蓝)Vit•C实验通过测定组织中的含磷量来计算组织核酸的含量。组织破碎后，经酸(常用三氯醋酸或过氯酸)和脂溶剂的提取，得到不溶于酸的非脂性磷化合物(AINLP).其主要成分为RNA磷(RNA-P)、DNA磷(DNA-P)、磷蛋白、磷和少量其他磷化合物。采用Schmidt-Thannhauser法，使AINLP降解出RNA和DNA的核苷酸。此法对植物组织不太适用，因为部分DNA为碱所裂解。上述分离的DNA和RNA降解物(核苷酸或多核苷酸)，去其无机磷化合物，再经强酸消化分解游离的碱醛，戊糖和磷酸，磷酸根PO43-在酸性溶液中能与钼酸铵反应生成戊磷钼酸铵，遇还原剂即变成“钼蓝”蓝色物质，其反应式如下：

H3PO4+12(NH4)3MoO4+21H+===(NH4)3PO4·12MoO3+12H2O+33NH4+钼酸铵磷钼酸铵(黄色)(NH4)PO4·12MoO3+

还原剂

(MoO4·4MoO3)2·H3PO4·4H2O

钼蓝(蓝色)

钼蓝产物于溶液中PO43-的含量成正比，用722型分光光度计660nm波长比色，当无机磷含量在1-25μg

范围内，光吸收和含磷量成正比，测出光密度而求出含磷量。

仪器10ml刻度离心管7支凯氏烧瓶1个10ml刻度试管10支研钵1个移液管数支离心机722分光计水浴锅(公用)试剂1、10%三氯醋酸(TCA)2、5%三氯醋酸3、95%乙醇4、乙醇-乙醚混合液=1：1(V/V)5、1NNaOH6、6NHCI7、4NNaOH8、0.1MCaCl211.10g稀释至1000mL9、浓H2SO410、磷酸盐标准液：称取0.4394gKH2PO4

移入1000mL容量瓶中加蒸馏水至刻度，加入一滴氯仿，以防微生物活动，其液含磷100μg/mL11、2.5%钼酸铵(不好溶)12、6NH2SO413、1、2、4酸还原剂：15%NaHSO3

实验步骤1、核酸的提取分离：取猪肝3.0g-3.5g，加入约1mL冷冻的10%TCA，在冷冻条件下研成匀浆，并搅拌3min，移入离心管，用少量冷冻的10%三氯醋酸(共约4-5mL)洗涤研钵，洗液一并倒入离心管，搅拌，离心3min(转速2000r/min)，弃去清液，于沉渣中加入2mL冷冻的5%TCA，搅拌2min，离心，弃清液，沉渣应不含酸溶性磷化物(即不含无机磷，可用1、2、4氨基萘酚磺酸检查)，此操作过程要迅速，以免发生自溶现象。加入5mL95%乙醇于上述沉渣中，搅拌，离心，弃清液，于沉渣中加入5mL乙醇-乙醚混合液，将离心管置于40-50℃热水中5min，搅拌，离心，弃清夜(含有脂溶性物质)，得到的沉渣即为AINLP。

将AINLP管加入2mL1NNaOH，于37℃保温15-20h进行碱水解(常振摇以确保充分碱解)。上述管内加入0.4ml冷的6NHCl及2ml冷的10%TCA，则DNA及蛋白沉淀，离心，上清液含RNA分解产物及磷蛋白磷，收集清液于10ml刻度试管中，再以2ml冷的5%TCA洗涤沉渣，离心，合并清液，稀释至刻度——待测RNA溶液。加入2ml5%TCA于沉渣中，置于90℃水浴上加热15min，搅拌，则DNA分解而蛋白质沉淀，离心，收集清液于10ml刻度试管中，再以2ml5%冷的TCA洗涤沉渣，合并清液，用水稀释至刻度——待测DNA溶液。2.核酸的水解：上述DNA和RNA提取液每种各取二份，每份2ml，分别移入4支10ml离心管，用4NNaOH中和至中性，各加0.5ml0.1MCaCl2

，离心除磷酸钙，溶液分别移入4支凯式烧瓶，加热蒸发大部分的水分，稍冷却，各管加入0.5ml浓H2SO4

水解约1h(溶液透明止)。产物为游离嘌呤嘧啶碱，戊糖和磷酸。3.标准曲线的制作和磷的测定

水解液分别移入4支10ml刻度试管，分别用蒸馏水1ml洗涤烧瓶两次，洗液分别并入各自的试管，以1NNaOH中和溶液，然后按上表进行操作。混匀10分钟后，选用660nm波长，以“0”号管调零分别测定OD值。21操作注意事项1.每人独立操作，不允许两人穿插取样；2.要求试剂及所有器皿清洁，不含磷；3.每管加样和测定均要求平行操作；4.消化溶液定容后务必上下颠倒混匀后再取样；5.各种试剂必须用移液管按顺序准确量取，移液管口用吸水纸