生物化学第34章兰州大学经典DNA的复制和修复名师优质课赛课一等奖市公开课获奖课件

第34章DNA复制和修复（DNAreplicationandrepair）一、DNA复制二、DNA损伤修复三、DNA突变第1页一、DNA复制（一）DNA半保留复制第2页DNA复制三种可能模式ConservativeSemiconservativedispersiveAfteronegenerationAftertwogenerations第3页Watson和Crick提出DNA双螺旋复制模型oldnew第4页DNA半保留复制试验证实

1958年，Meselson和Stahl利用15N标识大肠杆菌DNA试验，首先证实了DNA半保留复制。他们让大肠杆菌在以15NH4Cl为唯一氮源培养基中生长，经过连续培养12代，使全部DNA分子都标识上15N。15N-DNA密度比普通14N-DNA大，在氯化铯密度梯度离心时能够区分这两种DNA。第5页DNA半保留复制试验证实

这时将大肠杆菌转移到普通培养基（含14N）上培养，经过一代以后，全部DNA密度都介于15N-DNA和14N-DNA之间，说明这时DNA为14N和15N杂合分子。两代后，14N分子和杂合分子等量出现。当把杂合分子加热，使它们分开成单链再离心，可见有二分之一与单链15N-DNA密度相同，另二分之一与单链14N-DNA密度相同。第6页TheMeselson-StahlexperimentDNAextractedandcentrifugedtoequi-libriuminCsCldensitygradient第7页（二）DNA复制起点和方式

DNA上能独立进行复制单位称为复制子（replicon），每个复制子都有复制起始点，可能还有复制终点。DNA复制起始点普通有特定序列，DNA在复制起始点处解开双链，形成一个复制泡（也叫复制眼）。有些DNA复制从复制起始点开始向两边复制，也有些DNA复制从复制起始点开始向一边复制，它们分别称为双向复制和单向复制。第8页DNA复制方向未复制DNA单向复制双向复制第9页DNA复制方向

先将大肠杆菌在含有少许3H标识胸腺嘧啶培养基中培养，然后换到含有大量3H标识胸腺嘧啶培养基中短时间培养，放射自显影能够观察到复制叉。第10页中国仓鼠卵巢细胞DNA复制电镜照片大箭头所指为复制泡，小箭头所指为复制叉处单链部分，注意两个复制叉处单链部分在相反链上。第11页各种生物DNA结构

DNA有线性双链和环状双链，也有环状单链。原核生物染色体DNA和质粒，以及真核细胞中线粒体和叶绿体DNA都是双链环状，真核生物染色体DNA是双链线性。病毒DNA有单链环状，也有双链环状，还有双链线性。第12页DNA上复制子数目原核生物染色体DNA和质粒DNA就是一个复制子，从一个复制起始点开始完成整个DNA分子复制。真核细胞一个染色体DNA上有许多复制子，许多复制起始点同时开始复制，每一个复制起始点完成一段DNA复制，然后将各个片段连接起来。第13页复制起始点确定大肠杆菌染色体DNA只有一个复制起始点。在一个生长群体中几乎全部细胞染色体都在复制过程中，所以离复制起始点越近基因拷贝数就越多，也就是出现频率越高。将从大肠杆菌中提取出来DNA切成大约1%染色体长度片段，经过分子杂交方法测定各基因片段频率，结果表明复制起始点oriC位于基因图谱ilv位点处（83分附近）。一旦复制开始，复制叉向两侧以相等速度向前移动。两个复制叉在离起始点180°trp位点处（33分附近）会合。第14页大肠杆菌染色体DNA复制起始点确定第15页大肠杆菌多复制叉染色体第16页DNA酶促合成引物链和模板链第17页（三）DNA聚合反应相关酶第18页DNA聚合酶催化聚合反应5’端3’端DNA聚合酶第19页DNA聚合酶反应特点①以4种dNTP作底物；②反应需要接收模板指导；③反应需要有引物3’-羟基存在；④DNA链延长方向为5’→3’；⑤产物DNA性质与模板相同。第20页大肠杆菌DNA聚合酶

1955年，ArthurKornberg等发觉了大肠杆菌DNA聚合酶，以后又发觉了4种DNA聚合酶，分别称为DNA聚合酶Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ和Ⅴ，它们有各自不一样用途。（DNApolymerase）第21页TheNobelPrizeinPhysiologyorMedicine1959"fortheirdiscoveryofthemechanismsinthebiologicalsynthesisofribonucleicacidanddeoxyribonucleicacid"SeveroOchoaArthurKornbergNewYorkUniversity,CollegeofMedicineStanfordUniversity第22页TheNobelPrizeinChemistry"forhisstudiesofthemolecularbasisofeukaryotictranscription"RogerD.KornbergStanfordUniversity

Stanford,CA,USAb.1947第23页大肠杆菌DNA聚合酶Ⅰ

大肠杆菌DNA聚合酶Ⅰ由一条肽链（928个氨基酸残基）组成，含有一个锌原子，分子量103kD。它是一个多功效酶，含有以下活性：①5’→3’聚合活性；②3’→5’外切活性（校对活性）；③5’→3’外切活性（只作用于双链DNA）；④从3’端使DNA链发生焦磷酸解（聚合反应逆反应）；⑤无机焦磷酸盐与dNTP之间焦磷酸基交换。第24页大肠杆菌DNA聚合酶ⅠKlenow片段

用枯草杆菌蛋白酶裂解完整大肠杆菌DNA聚合酶Ⅰ，得到C端324～928氨基酸残基片段，称为Klenow片段。1-323氨基酸残基为小片段。小片段含有5’→3’外切活性，Klenow片段含有聚合酶活性和3’→5’外切活性。酶切位点Klenow片段第25页Klenow片段立体结构蓝色为模板链，红色为引物链。第26页Klenow片段活性位点第27页DNA聚合酶Ⅰ校对作用在正常聚合条件下，3’→5’外切活性不能作用于生长链；一旦出现错配碱基时，聚合反应马上停顿，生长链3’末端核苷酸落入3’→5’外切活性位点，错配核苷酸被快速切去，然后继续进行聚合反应。3’→5’外切活性起着校正确作用。

校对作用越强，DNA复制准确性越高。适当错配有利于发生突变，有利于物种进化。突变率太高也不利于保持物种稳定性。第28页DNA聚合酶Ⅰ切口平移作用第29页关于大肠杆菌DNA聚合酶研究依据对各种DNA聚合酶在大肠杆菌细胞中活性、合成DNA速度、该酶基因突变对DNA复制影响研究，发觉DNA聚合酶Ⅲ是大肠杆菌细胞中DNA复制主酶，而DNA聚合酶Ⅰ和Ⅱ功效只是参加DNA损伤修复。第30页大肠杆菌中3种DNA聚合酶性质比较项目聚合酶Ⅰ聚合酶Ⅱ聚合酶Ⅲ5＇→3＇聚合酶活性＋＋＋3＇→5＇外切酶活性＋＋＋5＇→3＇外切酶活性＋——相对分子量（×103）10388830一个细胞内分子数400？10~20生物学活性10.0515聚合速度（核苷酸/分）1000~2,40015,000~60,000连续合成能力3~2001,500≥500,000功效切除引物，修复修复复制第31页大肠杆菌DNA聚合酶Ⅲ亚基分子量亚基数目亚基功效α132,0002聚合活性ε27,00023’→5’外切校对活性θ10,0002组建关键酶τ71,0002关键酶二聚化γ52,0002依赖DNAATP酶，形成γ复合物δ35,0001可与β亚基结合，形成γ复合物δ’33,0001形成γ复合物χ15,0001形成γ复合物ψ12,0001形成γ复合物β37,0004两个β亚基形成滑动夹子，以提升酶连续合成能力第32页DNA聚合酶Ⅲ全酶结构δ与β结合两个α亚基各催化复制叉处一条链合成。第33页β二聚体滑动夹子结构红、绿色各为一个β亚基第34页DNA聚合酶Ⅳ和Ⅴ

DNA聚合酶Ⅳ和Ⅴ是在1999年才被发觉。它们功效是进行易错修复。第35页DNA连接酶大肠杆菌DNA连接酶能够连接切口和粘性末端，T4噬菌体DNA连接酶除能够连接切口和粘性末端外，还能够连接平末端。（DNAligase）第36页DNA连接类型第37页（四）DNA半不连续复制第38页DNA半不连续复制

在复制叉处，两条新生链是同时合成，新生链延伸方向一条是5’→3’，而另一条是3’→5’，这就不符合DNA聚合酶催化反应性质。为了处理这个矛盾，日本学者冈崎等提出了DNA不连续复制模型，认为3’→5’走向新生DNA链实际上是由许多5’→3’方向合成片段连接起来。第39页DNA复制叉处前导链和滞后链

5’→3’链是连续合成，3’→5’链是不连续合成，所以称为半不连续复制。第40页冈崎片段发觉

1968年，冈崎等用3H-脱氧胸苷标识T4噬菌体感染大肠杆菌，然后经过碱性密度梯度离心法分离标识DNA产物，发觉短时间内首先合成是较短DNA片段，接着出现较大分子，最初出现DNA片段长度约为1000个核苷酸左右，这种片段称为冈崎片段（Okazakifragment）。用DNA连接酶变异温度敏感株进行试验，在连接酶不起作用温度下，有大量DNA片段积累。这些试验都说明在DNA复制过程中，首先合成较短片段，然后再由连接酶连接成大分子DNA。第41页发觉冈崎片段试验第42页原核生物和真核生物冈崎片段细菌冈崎片段长度为1000～个核苷酸，相当于一个顺反子（cistron）长度；真核生物冈崎片段长度为100～200个核苷酸，相当于一个核小体DNA长度。第43页DNA复制中引物

因为DNA聚合酶必须在已经有核酸链3’-羟基上延伸新链，所以在前导链合成开始时以及滞后链每一个冈崎片段开始时都需要有引物。

RNA聚合酶以DNA为模板合成RNA过程称为转录，转录是不需要引物。DNA复制引物就是小片段RNA，这个RNA引物合成是由引物合成酶催化合成。RNA引物长度通常为几个核苷酸至十几个核苷酸。第44页（六）DNA复制过程DNAligaseDNApolymeraseⅠOldOkazakifragmentOkazakifragmentPrimerLaggingstrandtemplatePrimerHelicase/primaseNewlysynthesizedleadingstrandDimericreplicativeDNApolymeraseβsubunit“slidingclamp”SSBLeadingstrandtemplateDNAgyraseDNA复制叉处结构Primer第45页DNA复制时包括部分酶和蛋白质Gyrase：拓扑异构酶Ⅱ，旋转酶。Helicase：解旋酶。SSB（single-strandedDNAbindingprotein）：b单链DNA结合蛋白。Primase：引发酶，引物合成酶。Primer：引物。第46页拓扑异构酶拓扑异构酶能够改变DNA双螺旋连环数，其功效是引入超螺旋或解开超螺旋。拓扑异构酶可分为两类：类型Ⅰ酶能使DNA一条链发生断裂和再连接，反应无需提供能量；类型Ⅱ酶能使DNA两条链同时发生断裂和再连接，当它引入超螺旋时需要由ATP提供能量。第47页拓扑异构酶Ⅰ拓扑异构酶Ⅰ属于类型Ⅰ。它只能消除负超螺旋，对正超螺旋不起作用。拓扑异构酶在使DNA一条链断裂时，因为酶与DNA结合，DNA链不能自由转动，超螺旋扭曲张力不会自动消失。不过酶分子可牵引另一条链经过切口，然后使断链重新连接起来，从而改变DNA连环数和超螺旋数。第48页拓扑异构酶Ⅱ

拓扑异构酶Ⅱ属于类型Ⅱ，又叫旋转酶（gyrase）。它可连续引入负超螺旋，反应需要消耗ATP。在无ATP存在时，它能够松弛负超螺旋，但不作用于正超螺旋。

大肠杆菌旋转酶由两个A亚基和两个B亚基组成，A亚基是抗萘啶酮酸和奥啉酸作用位点，B亚基是抗香豆霉素A1和新生霉素作用位点。这些抗生素均能抑制DNA复制，因而推测旋转酶对DNA复制是必需。第49页旋转酶作用机制

喹诺酮类抗生素[（左氧氟沙星、环丙沙星和诺氟沙星（氟哌酸）]是人工合成萘啶酸衍生物，它们是经过抑制DNA旋转酶活性来杀死细菌。

第50页解旋酶（helicase）解旋酶能将DNA两条链解开，每解开一对碱基，需要水解2分子ATP。大肠杆菌有许各种解旋酶，其中解旋酶Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ能够沿着模板链5’→3’方向移动，而rep蛋白则沿着3’→5’方向移动。过去认为在DNA复制中，这两种酶配合作用解开DNA双链，但上述酶经诱变并不影响DNA复制。第51页DnaB蛋白

曾经分离出一些大肠杆菌DNA复制温度敏感突变株。其中一株当培养温度由30℃升高到40℃时，DNA复制马上停顿，分析表明dnaB基因发生了温度敏感突变。该基因产物DnaB是一个解旋酶，可沿DNA链5’→3’方向移动，由ATP提供能量。这就证实该解旋酶参加DNA复制。第52页单链DNA结合蛋白

大肠杆菌单链DNA结合蛋白（single-strandedDNAbindingprotein，SSB）由4个相同亚基组成，它功效是与已经解开单链DNA结合，阻止重新形成双链，保护单链部分不被核酸酶降解。

原核生物SSB蛋白与单链DNA结合有正协同效应，当第一个SSB蛋白结合后，后面SSB蛋白结协力可提升103倍。所以一旦结合反应开始，全部单链DNA快速被SSB覆盖。但真核生物SSB蛋白没有这种协同作用。第53页大肠杆菌染色体oriC结构第54页DNA复制起始Ⅰ超螺旋模板起始复合物DnaAtetramersApproachingbindingsitesDnaAtetramerOnbindingsites13-bpsegments9-bpsegments20-40moreDnaAmonomersWrappedDnaA-richregionoforiCHU、ATP第55页DNA复制起始时RNA聚合酶及HU蛋白作用AtleasttwootherfactorsparticipateinopencomplexformationatoriC.ThefirstoftheseisRNApolymerase.Thisenzymnedoesnotserveasaprimase,asitdoesinM13phagereplication,butitstillservesanessentialfunction.WeknowtheRNApolymeraseproductdoesnotserveasaprimerbecausewecanterminateitwith3’-dATP,whichlacksthe3’-hydroxylgroupessentialtoaprimer,andprimingstilloccurs.ButweknowRNApolymeraseactionisrequired,becauserifampicinblocksprimosomeassembly.TheroleofRNApolymeraseseemstobetosynthesizeashortpieceofRNAthatcreatesanR-loop.TheR-loopcanbeadjacenttooriC,ratherthanwithinit.ThesecondfactorisHUprotein.ThisisasmallbasicDNA-bindingproteinthatcaninducebendingindouble-strandedDNA.Thisbending,togetherwiththeR-loop,presumablydestabilizestheDNAdoublehelixandfacilitatesmeltingoftheDNAtoformtheopencomplex.第56页DNA复制起始Ⅱ开放复合物DnaB6·DnaC6hexamersDnaCsubunitsDnaBsubunitsOpenoriCregionDnaT第57页DNA复制起始ⅢDnaB有解旋酶活性，它每解开一个碱基对需要消耗2个ATP。预引发复合物SSBbindstosingle-strandedregionsUnwrappingOfDnaA-richregionSSBtetramersDnaBsubunitDnaBsubunitOpenregionPrimingandreplication第58页DNA复制体装配ⅠDnaBcomplexDnaBcomplexEndoforiCDnaAtetramerdisplacedDnaAtetramerdisplacedPrimasePrimosomeSSBtetrameronSingle-strandDNAPrimase,PriA,PriB,PriCPriB,PriC第59页DNA复制体装配ⅡRNAprimerleadingstrandRNAprimerlaggingstrandRNAprimerleadingstrandRNAprimerlaggingstrandDnaAtetramerdisplacedDnaAtetramerdisplaced第60页DNA复制体装配ⅢDNApolymeraseⅢholoenzymeDNApolymeraseⅢholoenzymeLastDnaAtetramerdisplaced第61页岗琦片段连接DNApolymeraseⅠDNAligase第62页DNA连接酶催化反应第63页DNA复制叉延伸第64页DNA复制叉延伸第65页DNA复制叉延伸第66页DNA复制终止

Ter位点是一个20bp短序列，其中含有一个保守关键GTGTGTTGT，Tus蛋白与Ter位点结合后起终止复制叉前进作用。第67页DNA复制终止DNAtopoisomeraseⅣ第68页replicationfactory第69页染色体分配第70页（七）真核生物DNA复制真核生物染色体有多个复制起始点。5-氟脱氧尿苷是细胞内胸腺嘧啶核苷酸合成抑制剂，用5-氟脱氧尿苷处理真核生物培养细胞能够抑制DNA复制，随即加入3H-脱氧胸苷就能够使DNA复制同时化。复制进行大约30分钟，然后制成DNA放射自显影图像，在电子显微镜下观察，能够看到很多复制眼，每个复制眼都有独立起点，并呈双向延伸。经过测量和换算，能够估算出复制子大小。第71页真核生物复制子哺乳动物复制子大多在100～200kb之间。人细胞有23对染色体，单倍体基因组大约有3×10

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bp，平均每个染色体有1000个复制子。果蝇或酵母复制子较小，平均为40kb。第72页真核DNA复制速度真核生物DNA复制叉移动速度比原核生物慢。大肠杆菌DNA复制叉移动速度为50,000bp/min，哺乳类动物复制叉移动速度仅为1000～3000bp/min。但因真核细胞染色体有许多复制起始点同时起始复制，所以总复制速度并不慢。第73页哺乳动物DNA聚合酶DNA聚合酶α(Ⅰ)DNA聚合酶β(Ⅳ)DNA聚合酶γ(M)DNA聚合酶δ(Ⅲ)DNA聚合酶ε(Ⅱ)定位细胞核细胞核线粒体细胞核细胞核亚基数目4122>1外切酶活性无无3’→5’外切酶3’→5’外切酶3’→5’外切酶引物合成酶活性有无无无无连续合成能力中等低高有PCNA时高高抑制剂蚜肠霉素双脱氧TTP双脱氧TTP蚜肠霉素蚜肠霉素功效引物合成修复线粒体DNA合成核DNA合成修复PCNA：proliferatingcellnuclearantigen，增殖细胞核抗原

DNA聚合酶α先合成一段约10个核苷酸RNA引物，再加上10~20个脱氧核糖核苷酸，作为DNA聚合酶δ引物。第74页细菌和真核生物复制体组成组成细菌真核生物复制酶DNA聚合酶Ⅲ全酶DNA聚合酶δ进行性因子β夹子PCNA定位因子γ复合物RF-C引物合成酶BnaGDNA聚合酶α去除引物RNaseH和DNA聚合酶ⅠRNaseH1和MF-1滞后链修复DNA聚合酶Ⅰ和DNA连接酶DNA聚合酶ε和DNA连接酶Ⅰ解旋酶DnaB（定位需要DnaC）T抗原消除拓扑张力旋转酶拓扑异构酶Ⅱ单链结合SSBRP-A第75页PCNA同源三聚体夹子第76页真核染色体末端复制

对于线性DNA复制，两条新链5’末端引物切除后出现缩短现象，这种现象会使染色体不稳定。第77页真核染色体末端复制

为了