生物31酶的制备及活力测定中图版选修名师优质课赛课一等奖市公开课获奖课件

3.1酶制备及活力测定第1页试验目标和要求1.掌握盐析法制备活性蛋白质原理及方法。2.掌握过氧化物酶活力测定方法。辣根过氧化物酶制备及活力测定第2页试验原理过氧化物酶催化以下反应2H2O2→O2+2H2O这一类酶以铁卟啉为辅基，所以属血红素蛋白质类(hemeproteins)。过氧化物酶在生物界分布极广，在细胞代谢氧化还原过程中起主要作用。第3页试验原理辣根过氧化物酶(horseradishperoxidase，简称HRP，EC.)是植物中研究得最深入一个过氧化物酶，早在20世纪30年代就有些人着手从辣根中分离此酶，以后又制备出结晶。本试验是以辣根为原料，经过水抽提，硫酸铵和丙酮分级分离，再经锌离子纯化，透析除盐，冰冻干燥，便可得到高纯度辣根过氧化物酶。第4页试验原理辣根过氧化物酶是一个含亚铁血红素蛋白质,Mr在40000左右，等电点7.2。溶于水，溶解度为5%(W/V)，溶液呈棕红色，透明。HRP可溶于0.58饱和度以下硫酸铵溶液，而0.62饱和度以上则不溶。该酶最适pH7.0(对愈创木酚为氢给体而言)。在室温下，HRP几周内稳定，加热到63℃，在15min内稳定。氧化还原电势很低，pH6.08时，E'0=-0.2070V，pH为7.71时，E′0=-0.2787V。第5页辣根过氧化物酶活力测定方法

1.RZ值：提纯工作后几步，以及纯酶溶液可用RZ值表明酶纯度。RZ=A403nm/A275nm，403nm处吸收代表血红素辅基吸收，275nm吸收是蛋白质吸收，结晶HRPRZ值为3.04。测定时酶浓度为1mg蛋白/mL。2.愈创木酚法：测k4。以愈创木酚(邻甲氧基酚，guaiacol)为氢给体，其反应产物四邻甲氧基连酚.有色产物四邻甲氧基连酚生成速度(dx/dt)与底物过氧化氢及氢给体愈创木酚浓度相关。本试验是采取测定k4方法来判断酶纯度。第6页试验步骤一、HRP制备

1.水提取：称取5kg用水冲刷洁净鲜辣根(辣根皮中亦含有丰富HRP)，用菜刀切成小碎块，在绞肉机中绞碎1～2次。碎渣浆用1倍体积水低温下搅拌提取过夜(亦可采取高速抽提法)。次日用甩干机(或离心机)甩干，搜集滤液，碎渣再用1/4倍体积水浸泡提取1次，合并2次滤液，测得总体积。第7页试验步骤2.硫酸铵分级分离：在不停搅拌下，每1000mL滤液中慢慢加入226g硫酸铵粉末(相当于0.40饱和度，0℃)，大约在1～2h内加完，置冷室中放置过夜。次日将上清液小心地用虹吸管移出，下面混浊液以3000r/min离心15min，弃沉淀，合并上清液。再按每1000mL上清液加258g硫酸铵粉末(0.8饱和度)随加随搅拌，当硫酸铵全部溶解后，置冷室过夜。次日，虹吸出上清液，沉淀部分在冰冻离心机中以13000r/min离心20min，弃去上清液，搜集沉淀。将沉淀悬浮于100～150mL蒸馏水中(加水量要使沉淀全部溶解为止)，分装于透析袋内，放在流动自来水中进行透析1～2天，直到硫酸铵透析完成为止(可用5%乙酸钡溶液或奈氏试剂进行检验)。然后改换成用蒸馏水透析，中间更换2～3次，用0.1mol/L硝酸银溶液检验透析外液无氯离子为止。将透析液合并，在冰冻离心机中以4000r/min离心15min，弃去沉淀，量上清液体积。第8页试验步骤3.丙酮分级分离：将上清液倒入烧杯并置冰盐浴中，在不停搅拌下，用细滴管沿杯壁加入1倍体积预冷至－15℃丙酮，放置片刻，在冰冻离心机中以4000r/min离心15min，弃去沉淀。上清液再加入0.8体积(按原上清液体积)－15℃丙酮，(操作同上)，静置后，在冰冻离心机中离心搜集沉淀。将沉淀溶于少许蒸馏水中，透析除丙酮。可得RZ值近于1酶溶液。第9页试验步骤4.精制：将上步酶液适当稀释，滴加1mol/L硫酸锌溶液，使酶液中锌离子浓度为10-3mol/L，5000r/min离心10min，得上清液。再将沉淀用少许蒸馏水洗涤，离心，洗液与清液合并，分装于透析袋内，用水透析除盐，用微孔滤膜过滤，进行真空冰冻干燥(约得20mg)，产品呈米黄色纤维状松软物，HRP产品RZ值可达3.0左右，置真空干燥器中低温保留。第10页试验步骤二、HRP活力测定1.活力测定：测定k4值方法操作以下：取2个比色池(带盖，光程1cm)，按表加入反应物。对照样品反应物磷酸盐缓冲液2.91mL2.90mL愈创木酚溶液0.05mL0.05mL酶液0.0mL0.01mL酶液：将1mg蛋白/mL酶液用磷酸盐缓冲液稀释10倍后使用。第11页试验步骤

加好反应物，摇匀，在470nm读出A470nm值，为t=0时读数。马上加0.01mL40mmol/L过氧化氢溶液于2个比色池中，即刻摇匀并记时，每隔30s读数1次，约5min，并记下试验时室温。将所测样品A470nm值减去对应时间对照A470nm值，然后以A470nm值为纵坐标，时间为横坐标作图，得一直线，计算出平均每分钟光吸收增加，即求出△x/△t，按公式(8)求出k4值。或不求k4值，而把在上述条件下，每分钟A470nm增加0.001所需酶量定为1个HRP活力单位。2.蛋白质含量测定：将酶液适当稀释后，用Bradford法比色测定蛋白质含量，第12页试验结果

1.计算产品RZ值及k4值。

2.计算产品比活力。第13页思索题1.盐析法制备辣根过氧化物酶原理是什么?2.愈创木酚法测定辣根过氧化物酶原理是什么?3.测定辣根过氧化物酶活力时，要求什么样pH和温度?是否需要先测定酶液蛋白质含量?第14页；/膜结构停车棚mqx60jop被子盖好了，轻轻地说“没有事儿，放心睡哇！”然后，耿老爹和耿正也急忙洗涮洗涮，就吹灯睡了。耿直和尚武到底年轻好睡，尽管知道今儿晚上可能有事儿，但这小哥俩和衣躺下以后，没过一会儿就都睡着了，但耿老爹和耿正却是翻来覆去怎么也睡不着。躺了一会儿，睡在火炕最东边耿正爬起来，把窗帘往两边拉一拉，中间留出一指宽一条缝；想一想，又把靠东边窗帘折起来拳头大小一个角。尽管看不到月亮，但夜空很是晴朗，模含糊糊地能看到东房前放着那个用篷布蒙了包裹着寿棺。耿老爹轻轻地说：“睡一会儿哇，即使有事儿也在后午夜！”耿正轻轻答应一声又躺下了。东边屋里，郭氏娘儿三个也急忙洗涮完后，就展开被褥准备睡觉了。郭氏突然发觉一大摞被子下面多了一条褥子，而且褥子下面那张被子看起来鼓鼓囊囊，就问耿英：“英子，这条褥子是你们带回来？下面那张被子，我看着怎么不对劲儿呢，没有这么厚哇！”耿英说：“这条褥子是俺们带回来。还有这被子，都先别管它们了，明儿个再说哇！天儿不早了，咱们睡哇，俺今儿个还真有点儿累了呢！”说着就和衣躺下了。郭氏问：“你怎么不脱了衣服啊？这么睡觉不解乏哇！”耿英只说：“今儿个晚上吃得不少，俺预计要起夜呢！”郭氏说：“那你到时候叫醒娘，娘陪你去啊！”耿英说：“你踏实睡觉哇娘，俺不怕，自家院儿里呢！”于是，郭氏也就不再说什么，吹灯睡了。也难怪，郭氏已经是五十出头人了，这一整天又哭又笑。高兴归高兴，身体实在是有些个乏困了，却也是真。看娘和妹妹已经睡熟了，耿英悄悄儿下炕来慢慢打开门，蹑手蹑脚地挪到堂屋橱柜前，小心地从里边抽出了那条三尺多长擀面杖来。然后，小心地拿回屋里轻轻放在自己被褥旁边。上炕以后，她又慢慢地爬到窗前将窗帘拉开一条缝，恰好能模含糊糊地看到东房前放着寿棺。然后重新躺下，心想，早听老人们说过，凡是入宅行窃歹人，通常都是在拂晓前最黑暗时候动手，俺应该抓紧时间先睡一会儿！但再一想，万一睡着了听不到窃贼来了岂不坏事，于是就不敢静心睡了。但无奈实在是太累了，以后也就不知不觉地睡着了。朦胧中，耿正突然听到“咚”一声。尽管声音并