毕业论文-维生素C修饰的纳米硒抗氧化性研究

JIANGXIAGRICULTURALUNIVERSITY本科毕业论文题目：维生素C修饰的纳米硒抗氧化性研究学院：食品科学与工程学院姓名：学号：专业：食品质量与安全班级：食安1301班指导教师：职称：讲师二0一七年五月目录TOC\o"1-4"\h\z\u摘要 引言纳米硒作为一种新研发出的产品，可以发挥硒的生物学和保健功效。它所具备的低毒性尤为关键。2000年，上海四通纳米技术有限公司将纳米硒产业化。获国家卫生部批准制成保健食品-硒旺胶囊[1]。2003年，陈君石院士指导进行亚慢毒性研究实验，其结果证明，纳米硒是最安全的硒制品，可长期食用[2]。这些优势使得纳米硒成为研究热点。抗氧化剂可以延长食物的存储期，防止氧化，增强其稳定性。在油脂中添加部分抗氧化剂如异抗坏血酸和维生素C能够避免油脂氧化。其作用机理为，利用抗氧化剂还原力，降低含氧量。抗氧化活性是纳米硒的重要生物活性之一，主要表现在纳米硒能够通过清除自由基对细胞进行保护，防止细胞被损伤和发生癌变[3]。Vc是人体需要量最大的一种维生素，并且可以作为抗氧化剂在体内发挥其作用，其能够使体内的一些自由基和活性氧基团消除，防止细胞因为被氧化而发生侵害、加强对铁元素的吸收、并且提高机体的免疫能力、降低癌症的病发率等。试验所选用的维生素C修饰的纳米硒（Vc@SeNPs）具有很好的稳定性，然而，对Vc@SeNPs的抗氧化能力测定目前未被研究到。试验通过测定Vc@SeNPs对还原能力以及超氧阴离子、羟自由基、DPPH自由基的清除能力，对Vc@SeNPs的抗氧化性能进行评价，从而进一步探究纳米硒的生物功能，为纳米硒在保健食品等行业的发展提供理论依据。1材料1.1试验材料：维生素C修饰的纳米硒（Vc@SeNPs）1.2试验试剂：1.3试验仪器：V5600型分光光度计北京长安科学仪器FA2104V型电子天平上海青浦仪器有限公司JW-1042低速离心机上海安亭科学仪器厂HH-66数显恒温搅拌循环水箱上海安亭科学仪器厂超声波清洗机宁波新芝生物科技股份有限公司2试验溶液配制1)9mmol/L水杨酸（用无水乙醇进行配制）：称取0.12g水杨酸，用无水乙醇进行溶解并移至100mL容量瓶，并定容至刻度。2）9mmol/LFeSO4：称取0.14gFeSO4，用蒸馏水对其进行溶解并移至100mL容量瓶，再用蒸馏水定容至刻度。3）8mmol/LH2O2：移取100µL30%的H2O2至100mL容量瓶中，蒸馏水定容至刻度。4）0.1mmol/LDPPH（用无水乙醇进行配制）：称取0.004gDPPH，用无水乙醇对其进行溶解并移至100mL容量瓶，最后用无水乙醇定容至刻度。5）50mmol/L（pH=8.2）Tris-HCl缓冲液：称取0.61gTris，用蒸馏水溶解、移至100mL容量瓶，用盐酸调pH，最后用蒸馏水定容至刻度。6)25mmol/L邻苯三酚：称取0.16g邻苯三酚,蒸馏水对其进行溶解并移至50mL的容量瓶，定容至刻度。7)0.2mol/L（pH=6.6）磷酸盐缓冲液：分别先配制0.2mol/L磷酸氢二钠溶液和磷酸二氢钠溶液，而后分别取上述溶40mL和60mL混合后就是0.2mol/LpH=6.6的磷酸盐缓冲液。称取磷酸二氢钠1.74g，磷酸氢二钠2.70g，氯化钠1.70g，蒸馏水溶解成400mL。8)1%铁氰化钾：称取1.00g铁氰化钾,加水99.00g，混匀即可。9)10%三氯乙酸：称取10.00g三氯乙酸,加水90.00g，混匀即可。10)0.1%三氯化铁：称取0.10g三氯化铁,加水99.90g，混匀即可。（实验所用水均为蒸馏水）3试验方法3.1清除羟自由基的能力测定用移液枪准确量取0.5mL不同浓度的Vc@SeNPs于试管中，先后加入0.5mL9mmol/LFeSO4和0.5mL8.8mmol/L过氧化氢，轻轻振荡混合后放置10min，最后每只试管分别加入0.5mL9mmol/L水杨酸，轻轻振荡混合后放置30min，在510nm处测吸光度Ai。将水杨酸替换为蒸馏水测其吸光度Aj，0.5mL的蒸馏水为参比做对照，测其吸光度A0。每组重复测量三次，取其平均值。用Vc溶液做阳性对照。羟自由基清除率E的计算公式为：E=[A0-（Ai-Aj）]/A03.2清除超氧阴离子自由基的能力测定用移液枪准确量取0.9mL50mmol/LpH=8.2的Tris-HCl缓冲液、0.4mL蒸馏水于试管中，25℃水浴中反应20min，然后用移液枪分别量取0.4mL不同浓度的Vc@SeNPs、0.1mL5mmol/L邻苯三酚于每支试管中，用手轻轻振荡使其均匀混合,在25℃水浴中反应6min，迅速移取0.2mL10mmol/L盐酸结束反应，在320nm处测其吸光值Ai，将邻苯三酚替换为蒸馏水测其吸光度Aj，0.4mL蒸馏水为参比做对照，测其吸光度A0。每组重复测量三次，取其平均值。Vc溶液做对照。超氧阴离子自由基清除率S的计算公式为：S=[A0-（Ai-Aj）]/A03.3清除DPPH自由基的能力测定用移液枪准确量取1.0mL不同浓度的Vc@SeNPs和0.1mmol/L的DPPH溶液1.0mL于试管中轻轻振荡使其混合均匀，避光条件下反应20min，在517nm处测其吸光度Ai，将DPPH替换为无水乙醇，测吸光度Aj；以蒸馏水为参比做对照，测其吸光度A0。每组重复测量三次，取其平均值。用Vc溶液做阳性对照。计算清除率I：I=[A0-（Ai-Aj）]/A03.4还原能力的测定用移液枪准确量取1.0mL不同浓度的Vc@SeNPs，并分别移取1.25mL的pH=6.6﹑0.2mol/L磷酸盐缓冲液和1%的铁氰化钾溶液于离心管中，轻轻振荡混合后，在50℃水浴中反应20min，迅速降至室温，移取10%的三氯乙酸1.0mL于每支离心管中，3000r/min的速度下离心10min。移取0.5mL上清液，并分别移取1.75mL蒸馏水和0.25mL0.1%的三氯化铁溶液于试管中，振荡混合后，在700nm处测其吸光值Ai。用Vc溶液做阳性对照。4结果与讨论4.1清除羟自由基的能力测定据前人研究，·OH具有较强的氧化性，基本上可以和全部细胞成分发生反应，且反应速率很快。硫酸亚铁与过氧化氢能够反应形成羟自由基，而水杨酸的加入将会使其生成有色物质，在510nm处有最大吸收。抗氧化剂添加后将与水杨酸争夺羟自由基，淡化其颜色或使其消失，以此判定其对羟自由基的清除能力。样品液Vc@SeNPs和VC对·OH的清除率如图1所示：在浓度范围之内样品液和VC对羟自由基的清除率随浓度的增大而增加；0.6mg/mL浓度下，VC对·OH的最大清除率接近85%；样品对·OH的清除率略低于VC，清除率为78.44%。图1VC和Vc@SeNPs对·OH清除率的比较Fig.1ComparisonofVCandVc@SeNPsfor·OHScavenging4.2超氧阴离子清除能力的测定邻苯三酚在Tris-HCl缓冲液（pH=8.2）中会发生自氧化反应，期间伴有O2-·和有色的中间产物，该有色的中间产物在320nm处有特征吸收。加入自由基清除剂即可阻抑产生中间产物和超氧阴离子，以此淡化颜色，减小吸光度。因此能够通过吸光度的变化，判定对O2-·自由基的清除能力。Vc@SeNPs和VC对超氧阴离子自由基的清除率如图2所示：在0.1-0.3mg/mL浓度范围内，VC对O2-·的清除率随着浓度的增大迅速增大，之后随着浓度的增大略有增大但变化不大；而样品溶液对O2-·的清除率在0.1-0.6mg/mL范围内随浓度的增加而增加，最高可达96.78%。样品对O2-·的清除率均低于同浓度下VC对O2-·的清除率。图2VC和Vc@SeNPs对O2-·清除率的比较Fig.2ComparisonofVCandVc@SeNPsforO2-·Clearance4.3清除DPPH自由基能力的测定DPPH自由基结构中的单电子，在乙醇中显现深紫色，是一种稳定的含氮自由基，在517nm处有特征吸收。抗氧化剂的加入，可使其氢与DPPH结合，导致颜色产生变化，吸光度也相应的发生变化，以此评价对DPPH自由基的清除能力。Vc@SeNPs和VC对DPPH自由基的清除率如图3所示：VC对DPPH自由基清除作用较强。在0.001--0.004mg/mL浓度内，VC对DPPH的清除率迅速增加，之后随着浓度的增加基本上无太大变化；而样品的清除率在试验浓度范围内随着浓度的增大而增大，呈量效关系，清除率最高可达56.91%，且清除率均低于同浓度下VC对DPPH自由基的清除率。图3VC和Vc@SeNPs对DPPH自由基清除率的比较Fig.3ComparisonofDPPHFreeRadicalScavengingRatewithVCandVc@SeNPs4.4还原能力的测定还原性物质将铁氰化钾还原，产生亚铁氰化钾；酸性环境中，Fe3+可以和亚铁氰化钾发生反应，形成普鲁士蓝，并在700nm处有特征吸收，吸光值随着浓度的增大而增大。Vc@SeNPs和VC具有还原性，Fe3+被还原为Fe2+，减小了普鲁士蓝的浓度。还原力随着吸光值的增大而增强，而抗氧化性随着还原力的增强而增强。Vc@SeNPs和VC的还原能力如图4所示：在浓度0.1--0.3mg/mL范围内，VC的吸光度明显大于样品的吸光度；但继续增大浓度，VC的吸光度略小于样品的吸光度。图4VC和Vc@SeNPs的还原能力的比较Fig.4ComparisonofreductioncapabilitieswithVCandVc@SeNPs5结论通过测定Vc@SeNPs的还原能力以及清除DPPH自由基、羟自由基、超氧阴离子的能力，评价其抗氧化活性。Vc@SeNPs对自由基的清除率及还原力均随浓度的增加而增加。其中，Vc@SeNPs对自由基清除率与Vc相近，而浓度超过0.4mg/mL时，其还原力略大于Vc。试验结果表明，Vc@SeNPs具有抗氧化作用。参考文献[1].非凡的、必需的和谜一般的纳米硒：与纳米硒第一发明人张劲松博士的对话[J].医药世界,2004,10:20-23.[2]林根.陈君石:“纳米硒在世界上是独一无二的”[J].医药世界,2004,10:12-14.[3]杨梦涛.纳米硒—牡蛎多糖的制备及其抗氧化活性研究[D].中国海洋大学,2014.[4]李彩霞，李复兴，李鹏，等.国槐叶黄酮的抗氧化活性研究[J].天然产物研究与开发，2013,05:676-680,683.[5]杨润亚，明永飞，王慧.无花果叶中总黄酮的提取及其抗氧化活性测定[J].食品科学，2010,16:78-82[6]南海娟，莫海珍，颜振敏，等.槲树叶黄酮的抗氧化特性研究[J].中国食品添加剂，2013,02:83-87[7]顾采琴，张织芬，朱冬雪，等.香蕉果皮黄酮抗氧化活性研究[J].广州大学学报(自然科学版)，2013,03:12-16[8]ZoranMaksimovie,DordeMaleneie,NadaKovacevie.PolyphenolcontentandantioxidantactivityofMaydisstigmaextraers[J].BioresourseTechnology,2005,96：873-877.[9]BekiasTePe,MuneoerSoklnen.InvitorantioxidantactivitiesofthemethanolextractsoffiveAlliumspeciesfromTurkey[J].FoodChemistry,2005,92:89-92.[10]KhizarHayat,XiaomingZhang,UmarFarooq,etal.Effectofmicrowavetreatmentonphenoliccontentandantioxidantactivityofcitrusmandarinpomace[J].FoodChemistry,2010,123:423-429.致谢在导师呕心沥血的帮助下，我终于完成了毕业实验。在这期间，我利用大学期间学到的专业知识