1蔡司显微镜知识显微操作

显微操作技术(倒置显微镜)

2007年09月19日

三22:23

显微操作技术(倒置显微镜)（micromanipulationtechnique）

显微操作技术（micromanipulationtechnique）是指在高倍复式显微镜下，利用显微操作器

（micromanipulator）进行细胞或早期胚胎操作的射针在显微镜视野内移动的机械装置。

法。显微操作器是用以控制显微注

显微操作的基础

--倒置研究级显微镜（例如caikonXDS-500C）各种活细胞应用实验，如

显微操作、细胞培养，IVF，ICSI等.

显微操作技术（micromanipulationtechnique）是指在高倍复式显微镜下，利用显微操作器

（micromanipulator），这是一套能控制显微注射针在显微镜视野内移动的机械装置，用来

进行细胞或早期胚胎操作的

法。显微操作技术包括细胞核移植、显微注射、嵌合体技

术、胚胎移植以及显微切割等，像是

的产制就是运用细胞核移植技术达成的；而

转殖（genetransfer）指的是将选殖之外源生殖细胞

藉由导入体细胞并能稳定的嵌入宿主动物之

源

引入体内

而引起

改变之动物，并可将遗传特质传递至接续的每一世代中。产制

转殖动物可利

用 显微注射（genemicroinjection）、胚干细胞（embryonicstemcells,EScells）、

载体（spermvector）、反转录

（retroviralvectorinfection）及体细胞核

移置（somaticcellnucleartransfer）等方法达成，其中显微注射为目前应用最普遍之方法之一。显微注射法（microinjection）是利用管尖极细（0.1至0.5μm）的玻璃微量注射

针，将选殖之外源

片段直接注射入原核期胚或是培养的细胞中，然后藉由宿主

组序

列可能发生之重排（rearrangement）、删除（deletion）、重复（duplication）或易位

（translocation）等现象而使外源

嵌入宿主之

内。这种显微注射术的程序，需有

相当精密的显微操作设备，于制造长管尖时，需用微量吸管拉长器（micropipettepuller），

注射时需有固定管尖位置的微量

器。这种技术的长处为任何DNA在原则上均可传入任何

种类的细胞内。此法已成功的产制包括小鼠（mouse）、鱼、大鼠（rat）、兔子及许多大型

家畜，如牛、羊、猪等前已证明数百kb之DN

转殖动物。以显微注射法转殖之外源

较无长度上之限制，目

段均可成功产制出

转殖动物。而其缺点为其设备经密昂贵、操

作技术需要有相当时间的练习，及每次只能注射相当有限的细胞。

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用于显微注射用之显微镜常使用具有位相差(phasecontrast)与微分 差(differential erferencecontrast)功能之倒置显微镜(例如 光学仪器厂的倒置显微镜XDS-300C或者XDS-500D)，倒置显微镜组成和普通显微镜一样，只不过物镜与照明系统颠倒，一般正置显微镜之物镜在载物台之上，照明系统在下，而倒立式显微镜之物镜在下与而照明系统在载物台之上，倒立式显微镜之优点为接物镜与目镜间之工作距离较长，可直接将培养皿之置显微镜操作台上进行显微注射等工作。传统之一般普通显微镜无法直接观察 染色之透明的活细胞，为了能让显微注射技术观察与操作透明的活细胞样品，显微镜须使用具有位相差与微分 差功能之倒立式显微镜。位相差显微镜是由P．Zernike于1932年发明，并因此获得1953年 物理奖，这种显微镜最大的特点是可以观察 染色的透明标本和活细胞，位相差显微镜的基本原理是利用透明细胞检体内部折射率各不相同，把透过标本的可见光的光程差变成振幅差，从而提高了各种结构间的

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为解决活动样品和厚样品带有「光晕」的观察问题，1952年，Nomarski在相差显微镜原理的基础上发明了微分 差显微镜（differential

microscope）。Nomarski微分

差显微镜之优点是能显示结构的三维

与传统位相差显微镜相比，其标本可略厚一点，折射率差别更大，故影像的

感更强，

产生类似于浮雕的效果。微分

差显微镜技术设计比相差显微镜要复杂得多，Nomarski

DIC利用的是偏振光，有四个特殊的光学组件：偏振器（polarizer）、DIC棱镜、DIC滑行器和检偏器（

聚光器中则安装了二个楔形单轴的晶体,如石英,以光轴互相交错的方式互相接合，称为Wollaston棱镜或Nomarski棱镜，即DIC棱镜，此棱镜可将每一光线分离成为二条偏振互相垂直的两束光（x和y），二者成一小夹角，聚光器将两束光调整成与显微镜光轴平行

的方向。最初两束光相位一致，在穿过标本相邻的区域后，由于标本的厚度和折射率不同，

引起了两束光发生了光程差。在物镜的后焦面处安装了第二个Wollaston棱镜，即DIC滑行器，它把两束光波合并成一束，这时两束光的偏振面（x和y）仍然存在。最后光束穿过第二个偏振装置，即检偏器，在光束形成目镜DIC影像之前，检偏器与偏光器的方向成

直角，检偏器将两束垂直的光波组

具有相同偏振面的两束光，从而使二者发生

。

x和y波的光程差决定着透光的多少，当光程差值为0时，没有光穿过检偏器；光程差值

等于波长一半时，穿过的光达到最大值，于是在灰色的背景上，标本结构便呈现出亮暗差。

为了使影像的反差达到最佳状态，观察者可通过调节DIC滑行器的纵行微调来改变光程差，

改变光程差可以改变影像的亮度。而调节DIC滑行器则可使标本的细微结构呈现出正或负

的投影形象，通常是一侧亮，而另一侧暗，这便造成了标本的人为三维

感，产生了类

似大理石上的浮雕感觉。DIC显微镜使细胞的

结构，特别是一些较大的细胞器，如核、

线粒体等，

感特别强，因此适合应用于显微操作技术。目前像

注入、核移植、转

等的显微操作常需要在这种显微镜下进行。

虽然Nomarski微分

并且仅仅只能应用在玻璃底的培养皿中，无法直接在广为研究

进行细胞培养操作之一

般

材质的培养皿产生浮雕效果，此外这种技术对于显微操作技术的所使用的样品而

言，景深还是稍嫌察厚样品的微分

技术也逐渐被开发出来，

对比度，得到明暗对比的效果，使的透明活细胞各种结构 细节在亮背景视野中变得清晰可见，位相差显微镜之基本构造是利用位相差聚光镜及 位相环所 的环状光圈，光通过聚光镜后，产生中空光锥，并在光线穿过检体后发生折射，偏离了原来的光路，同时被延迟了1/4λ（波长），如果再经过物镜内的光延迟位环板而成增加或减少1/4λ，则光程差变为1/2λ，两束光合轴后 加强，振幅增大或减下提高反差。虽然相差显微镜可以在透明的细胞样品提供清析的观察图像，但是一般位相差显微镜的缺点是会有「光晕」现象的产生，因而导致观察的景深受限制，无法用以观察较厚的样品，较厚的细胞团区域在一般位相差显微镜下的清稀度十分糟糕，而且边缘常产生晕轮效果，如果观察样品中有超过85%以上的区域为较厚细胞时，这个问题将非常严重，然而显微注射用之样品如

卵细胞或细胞团均具有一定厚度，造成细胞结构和边缘无法清楚可见，因此显微注射用的显微镜必须要能克服厚样品 。

例如 光学仪器厂就推出了自己的浮雕相衬（RC）装置

浮雕相衬系统能够产生

高反差的3D图像，类似于DIC效果，可用于

器皿中的样品。浮雕相衬用于细胞

，

使细胞核膜更容易看到和穿刺。适应于所有类型的细胞,组织(无论

,染色,未染色),

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目前最常用来生产 转殖动物的方式为：直接把重组过的DNA注入授精卵的原核(pronuleus)中，将从胚胎提供者的 中取得的授精卵移到倒立式显微镜上的微量注射台上，然后利用固定吸量管(holdingpipette)固定住，之后注射针则依序穿过zonapelluci ocytemembrance及malepronuleusmembrane后，将DNA注入，注入时可以见到原核膨大。以小鼠 卵雄原核之显微注射为例，显微注射所使用的 卵之固定吸管（holdingpipette）及注射针（injectionneedle）之 ，除影响操作时间外，亦是影响 转殖效率及 注入后之胚存活及 转殖成功与否极其重要的因子。固定吸管之内、外径分别为30、80μm较为适当的。显微注射针自针尖起20μm处之外径为4μm时，可获得良好的转殖效率。固定吸管之内径如太小，会导致吸力 ，对受精卵操控不易，如太大，则 卵易受 ，影响胚之存活率。显微注射针尖如太粗，则导致 透明带及原核之阻力增加，且DNA流量过多， 卵易于裂解，太细则致针内DNA流出速率过慢，且易阻塞，而使DNA无法顺利流入原核内，影响注射效率。因此进行

卵雄原核之显微注射时，如何 适用之固定 卵之吸管及显微注射针是关乎 转殖效率极其重要的 。

转殖动物（transgenicanimal）于目前生物及医学研究方面之应用极为广泛，转殖小鼠一直是研究外源 构筑型态、 嵌插、转殖

也是建立 转殖技术最好的工具，尤其是在产制 转殖家畜之前，如能先以小鼠进行预备试验是求事半功倍不可或缺之过程。 转殖动物应用的领域可以包括研究 的活动对 与癌细胞的生长的影响、 的活动与免疫细胞间的交互作用与调控的机制、研究 对于生长的调控机制，以及生物学与遗传学的机制，也被应