人前列腺癌PC3细胞亚群的分离及其生物学行为分析

人前列腺癌PC3细胞亚群的别离及其生物学行为分析【摘要】目的研究人前列腺癌P3肿瘤细胞系中是否存在具有干细胞特征的细胞亚群，并对其形态及克隆生长特征进展分析，同时讨论染料Rh123着色强度是否可用于区分不同的肿瘤细胞亚群。方法采用Rh123染色后流式细胞仪分析;Rh123与DAPI复染后荧光显微镜下形态学观察及细胞克隆生长特征分析等方法。结果P3细胞中存在对Rh123着色显著差异的两类细胞亚群，其形态构造、增殖才能及克隆生长方式均有明显差异。结论人前列腺癌P3细胞系中存在具有干细胞特性的细胞亚群，对Rh123拒染的特性可用于区分肿瘤干细胞与其他肿瘤细胞。【关键词】前列腺癌;罗丹明123;肿瘤干细胞研究说明，肿瘤细胞群体中只有一小局部细胞具有形成新肿瘤的才能而被称为肿瘤起始细胞(turinitiatingell，TI)，由于具有自我更新和分化潜能也被称为癌干细胞(anersteell，S)。这局部细胞的显著特征是具有极强的潜在增殖、侵袭和迁移才能，对辐射和化疗药物不敏感，是肿瘤转移和复发的根源〔1〕。迄今已先后在白血病及乳腺癌、神经胶质瘤、结肠癌等实体肿瘤中证实了S的存在，并发现了一些S的生物标志物。但S生物标志物也为正常组织干细胞所共有，而且别离后培养极易分化。因此迫切需要寻找一条S别离的捷径。罗丹明(Rh)123为亲脂性荧光染料，可快速通过细胞膜，在细胞内主要分布于带负电荷的线粒体基质。高表达ABG2/BRPl的细胞可连续将Rh123泵出细胞而拒染，Rh123弱染的特征已被成功用于别离白血病干细胞〔2〕。本研究利用细胞对Rh123着色差异这一特征，采用流式细胞术分析前列腺癌P3细胞是否存在Rh123高与低染色亚群，并比拟两个亚群的差异性，讨论Rh123淡染细胞是否具有S特性。1材料与方法1.1材料人前列腺癌细胞株P3为吉林大学白求恩医学院病理教研室保存，F12培养基为Gib产品，标准胎牛血清购自天津血液病研究所，胰蛋白酶为Ares产品，Rh123、DAPI购自碧云天公司。1.2仪器荧光倒置显微镜为LEia公司产品，倒置显微镜为lypus公司产品，流式细胞仪为美国BD公司产品。1.3细胞Rh123染色强度的流式细胞分析方法细胞培养在含10%胎牛血清的F12培养基中，置于5%2、37℃孵箱培养。待细胞到达指数生长期，常规胰酶消化，3次PBS清洗后，制成单细胞悬液(1×107细胞/l)。等分细胞悬液，一组为背景对照，另一组参加Rh123染料至终浓度为2μl/L，37℃避光孵育30in(每10in将细胞轻轻悬起)，再经PBS清洗2次，最终将细胞重悬于500μlPBS溶液。经200目滤网过滤后进展流式细胞仪分析，激发光波长为507n，每组分别检测1×104个细胞。1.4细胞Rh123染色后凋亡检测取指数生长期细胞常规消化、制备成单细胞悬液，调整密度为5×105个/l，取500μl细胞悬液滴至24孔培养板中的盖玻片上，放入培养箱中过夜。次日吸去培养基，PBS洗2次，参加无血清F12培养基，再参加Rh123至终浓度为2μl/L，37℃避光孵育30in，在孵育10in时再参加DAPI染色液至终浓度为0.5μg/l。期间每隔10in轻轻震荡1次，吸去染色液，PBS洗2次，分别于507n、340n波长激发Rh123与DAPI，荧光显微镜下观察染色情况，分析淡染细胞核状态是否为凋亡细胞。1.5细胞克隆及生长特征比拟分析取指数生长期细胞常规消化，吹打成单细胞悬液，调整密度至10个/l，取0.1l细胞悬液滴加至96孔培养板中，次日进展Rh123染色，倒置显微镜下观察，挑选只含有1个细胞的孔，标记Rh123淡染细胞。培养到第14天时再进展Rh123染色，观察克隆形成情况及染色情况。转贴于论文联盟.ll.2结果2.1前列腺癌P3细胞中存在Rh123着色不同的细胞亚群染料Rh123结合流式细胞术观察P3细胞系中Rh123淡染细胞的比例。结果显示，背景对照组的P3细胞系无自身荧光，经Rh123染色后出现明显的双峰，且两峰内细胞的荧光差异较明显，经重复后结果一致，即P3细胞中存在淡染和深染两种亚群细胞。见图1。图1P3细胞Rh123染色流式细胞仪分析图2.3两亚群细胞具有不同的形态构造、增殖才能、集落生长方式为观察Rh123淡染细胞亚群的单个细胞增殖才能及增殖细胞的特点，进展了克隆形成实验。细胞培养至第14天，镜下可见Rh123深染细胞分裂增殖产生的细胞几乎全为Rh123深染，且细胞之间排列比拟松散;Rh123淡染细胞分裂增殖产生的细胞绝大局部为Rh123淡染细胞，细胞间排列较严密(图3)，且Rh123淡染细胞增殖才能明显强于Rh123深染细胞。3讨论1996年Gdell等〔3〕利用DNA染料Hehst33342为鼠造血干细胞染色并进展荧光活化细胞分选系统(flureseneativatedellsrting，FAS)分选时，发现一小群具有弱荧光染色特性的细胞呈彗星状分布在主群细胞的一侧，他们将这群细胞称为侧群(sideppulin，SP)细胞，也称边群细胞，SP细胞的这种弱染色表型称为SP表型。近年来在成体多种组织、胚胎甚至肿瘤细胞中都发现了SP细胞〔4，5〕，他们同源性高，具有自我更新和分化潜能，在体内可以分化产生不同组织类型的细胞〔6，7〕，说明SP细胞具有类似于干细胞的自我更新和多向分化潜能，在一定程度上可以代表干细胞作为研究干细胞的重要资源，尤其在一些外表标志未知的S。因此别离S，对其生物学特征及在肿瘤发生和进展中作用的研究，以及寻找S生物标记物，以其为靶点进展靶向治疗已成为肿瘤生物学研究及防治研究的新热点。国外研究者在脑肿瘤和乳腺癌中做了初步尝试，多借鉴正常干细胞的别离方法，包括细胞外表标志、球形培养和SP别离等〔8〕。某些癌细胞和干细胞能通过细胞外表的P糖蛋白将进入胞内的Rh123主动外泵至胞外，表现为低荧光的特征，可分选为Rh123低染和Rh123深染两个亚群。本研究发现，前列腺癌P3细胞对Rh123染料着色不同，即P3细胞中存在Rh123淡染的亚群细胞，1×104个细胞中约占7.2%，且经DAPI染色发现这些Rh123淡染的细胞并非细胞凋亡所致。进一步的克隆形成实验证实，Rh123淡染细胞形成的克隆细胞排列严密，细胞形态大小一致，并且分裂增殖才能明显强于Rh123深染细胞，即前列腺癌