新入职同事学习-camag现代薄层色谱

卡玛-薄层色谱的全球者创建于1958年，总部位于巴塞尔。超过50年薄层色谱仪器研发的经验欧洲药典薄层色谱13A,13B及中药组集•中国药典薄层色谱彩唯一技术顾问药典(USP)局（FBI)国家科学

(NSF)分析化学家

(AOAC)薄层技术顾问草药典(AHP)合作伙伴药典植物化学 组成员••层色谱的广泛应用领域法医Foresnic环境Environment中草药Herbals化妆品Cosmetic制药Pharmaceutical临床Clinical兽药/饲料Veterinary/Feedstuff食品FoodTLC在中药质量控制中的主要应用Identification

鉴别Semi-tative

assessments

半定量评估tation

of

marker

compounds

化合物定量分析鉴别白术、苍术的区别：TLC板上白术中苍术酮的特征粉红色以及苍术中苍术醇所具有的暗绿色斑点，甚至在没有任何化学对照品的情况下也能够很容易地被识别。白术(Rhizoma

Atractylodismacrocephalae)苍术(Rhizoma

Atractylodis)鉴别小通草（

Stachyurus

himalaicus）伪品（

Kerria

japonica

）半定量评估—过程控制人参提取物与人参原料药材的HPTLC

图谱比较(示提取工艺造成人参皂苷水解）2，Ginseng

extract

3，4,

ginsengroot1

2

3

4范的成品作为参比物。1，Ginsenosides

reference1

2

3

4HPTLC

图谱通常用于生产和过程开发，建立合适的提取参数、提取物定标及检测配方过程中原料的改变或降解。利用HPTLC

图谱，通过比较斑点数目、顺序和相对强度（或者光密度扫描产生的峰）可以完成这些工作。可以用鉴定过的原料或有独立规半定量评估—稳定性测试羊荆萃取物强制降解后的HPTLC

色谱图从左到右分别为：对照品、光照降解、HCl降解、NH3降解、TFA降解、DEA降解、H2O2

降解、加热（溶解萃取）、加热（干萃取）、氧化。稳定性测试是HPTLC比较新的一个应用，用以确定提取物和成品的保质期。测试是要确认产品在规定时间内能否保持稳定。半定量评估—限量检查采用定量配制的对照品对照或对照品稀释对照。供试品溶液色谱中待检查的斑点应与对应的对照品溶液或系列对照品溶液的相应斑点比较，颜色（或荧光）不得更深。或照薄层色谱扫描法操作，峰面积值不得大于对照品的峰面积值。必要时应规定检查的斑点数和限量值。化合物定量分析The

content

of

Berberine

in

Rhizoma

Coptidis

measured

in

fluorescence

scanned

modelinear

range：18.28ng～329.04

ngregression

equation

：Y=720.146+34.942X

r=0.9981,

RSD=3.80BerberineBerberine小檗碱化合物定量分析对TLC来说是最高要求。由于受到该技术分离能力的限制，复杂样品对其所有组分往往不能实现基线分离。然而，人们往往忽视，如果采用合适的仪器和方法，HPTLC

实现定量分析也不难。HPTLC

方法的确立PlatePreparation薄层板选择与处理Solution

TestPreparation供试品Chromatogramdevelopment展开SampleSelection样品选择SampleApplication点样Derivatization显色Detection检视TLC

重现性？?Lab

ALab

B薄荷(Mentha

haplocalyx)和留兰香(Mentha

spicata)的鉴别CAMAG

HPTLC

SOPCAMAG

高效薄层色谱标准操作规程4展开ADC

23点样ATS

412高效薄层板5衍生化CID

Ⅲ6成像VisualizerWinCATs87扫描Scaner

4CAMAG-HPTLC

现代化薄层色谱CAMAG

HPTLC

SOP1.TLC

Plates薄层板1.薄层板TLC

Plates烟台市化学工业

：“银龙”高效硅胶预制板：HSG、HSGF254普通硅胶预制板:

SG、

SG

F254青岛海洋化工厂分厂：“海洋”高效硅胶预制板：HSG、HSG

F254普通硅胶预制板:SG、SG

F254Macherey-Nagel:DC-Fertigplatten

Nano-durasil-20DC-Fertigplatten

Nano-durasil-20

UV254DC-Fertigplatten

SIL

G-25DC-Fertigplatten

SIL

G-25

UV254HPTLC-Fertigplatten

Nano-durasil-20HPTLC-Fertigplatten

Nano-durasil-20

UV254Merck:TLC

Silica

gel

60HPTLC

Silica

gel

60TLC

Silica

gel

60

F254HPTLC

Silica

gel

60

F254硅胶（Silica

Gel，首选）Silica

gel

60,40,25氧化铝（Aluminum

oxide）反相（RP-Layers）手性（Chiral

phases）纤维素（Cellulose）聚酰胺（Polyamide）硅藻土（Kieselguhr）其他选择TLC还是HPTLC？球形硅胶整体硅胶非晶硅胶HPTLCTLCUPTLC硅胶涂层选择TLC还是HPTLC？TLC及HPTLC参数比较：参数TLCHPTLC平均粒径10

-

15µm3-

7µm粒径分布5-

20µm3-

8µm薄层厚度250µm100-

200µm样品数目Max

12Max

36展开距离100-

150mm30

-

70mm展开时间30

-

200min3-

20min溶剂消耗50

mL5-

10

mL检测限（吸收）100

–

1000

ng10

-

100ng检测限（荧光）1-

100ng0.1

-

10ng选择TLC还是HPTLC？A.

TLCB.HPTLC薄层板规格cm展距cm展开时间/min消耗展开剂/mlTLC20x

20123225HPTLC20x

107810TLC

&HPTLC

参数比较使用预制商品板,

采用HPTLC

薄层板德国MN(Macherey

Nagel)、德国Merck薄层板使用前建议预洗和活化1.薄层板TLC

Plates1.薄层板TLC

Plates氯仿-甲醇（8：2）洗涤预洗前背景干扰，严重影响斑点检出薄层板使用前建议预洗和活化CAMAG

HPTLC

SOP2.Sample

Application点样2.点样Sample

Application点样是平面色谱中最重要的步骤点样过程中产生的误差无法通过色谱展开和计算来校正2.点样Sample

Application点状点样、条带状点样、矩形点样等多种方式点样。点状点样条带点样3.矩形点样2.点样Sample

Application斑状样品点样的一般点样位置（a

﹥

15mm,b=10mm,c两起点之间的距离,要求c≧5mm。）2.点样Sample

Application条状样品点样的一般点样位置（a

≧15mm,b=10mm,c=两起点之间的距离，d=8~10mm）。一般c-d≧5mm，6mm≦d≦10mm，2.点样Sample

ApplicationCAMAG HPTLC

的标准SOP：一般采用条带状点样，带宽8~10mm（TLC),5~8mm（HPTLC)，高度不超过1mm点状点样，直径一般不大于3mm（TLC）。采用接触式时尽量不要损伤薄层板定量点样，提高样品色谱和对照药材色谱可比性点样时应注意选择适宜的溶剂。样品的溶解度、溶液粘度等均会对点样质量产生影响。2.点样Sample

Application点状点样：简单快速缺点：接触式点样，易损伤薄层板表面；点样量低斑点容易点大，易产生溶剂环形色谱效应，影响分离效果条带状点样：优点：一般喷雾式，不损伤薄层板表面点样量比点状点样大原点不会上下扩散，分离度增加2.点样Sample

Application手手喷喷手手喷喷动动雾雾动动雾雾点点点点条条条条状状状状带带带带点样Sample

Application适用于点状点样使用方便,成本经济不损伤薄层表面固定相定量毛细管(0.5,1,2,5

µL)满足定量要求(RSD<2%)√90°×3.点样Sample

Application分离采用非接触喷射技术适合于条带状点样高动态点样体积(0.1-500

µL)工作站

控制点样点样数据直接导入定量分析满足定性、定量分析和符合GLP,cGMP要求3.点样Sample

Application•工作站

控制全自动点样极高的精度及重现性大量节省点样时间模式可在任意位置点样加热附件消除斑点扩散现象符合GLP，cGMP要求点样数据直接导入定量分析CAMAG

HPTLC

SOP3.Development展开3.展开Development展开是薄层色谱中受影响因素最多的步骤展开剂的选择、不同展开方式、温度、湿度、展开距离对成分分离的影响。其中展开湿度的影响值得重视且较难控制。

《中国药典薄层色谱彩 集》记录了操作时的温度和相对湿度，强调在相似的环境下操作，以提高图谱的重现性。3.展开-展开剂的优化3.展开-湿度对Rf值的影响RH:28%RH:60%RH:85%RH:32%RH:32%RH:32%普通双槽层析缸展开不同环境湿度异板及日间精密度比较CAMAGADC2展开不同环境湿度异板及日间精密度比较3.展开-湿度对Rf值的影响连翘的薄层色谱的湿度：*为连翘苷18%

32%

47%

58%

65%

72%18%

32%

47%

58%

65%

72%A.

Relative

humidity

17%B.

Relative

humidity

47%C.

Relative

humidity

75%不同相对湿度—1个样品—18个轨道重复点样A.17%B.47%C.75%全自动展开系统ADC

2薄层色谱扫描Scaner

43.展开-湿度对Rf值的影响饱和及预平衡对TLC的影响展开剂:二氯乙烷–甲醇–异丙醇–氨水（50:10:10:2）展开时间：22min17min13min3.展开-ADC2用标准化的展开条件在传统玻璃层析缸中进行全自动色谱展开。全自动饱和度控制湿度控制（15%～85%）无与伦比的重现性可进行IQ/OQ验证全自动多步展开系统AMD

23.展开AMD2-多级展开系统AMD2，分步梯度展开系统，可在HPTLC薄层板有限的展开距离内达到最大的分离效果如8cm展距，可分离40多个成分，其分离能力可与HPLC相媲美。20

步等度梯度展开1N

25%氨水溶液预平衡从Methanol/Water(98/2)起始，经氯仿最终至正己烷全自动多步展开系统AMD

23.展开AMD2-多级展开系统AMD分离杀虫剂CAMAG

HPTLC

SOP4.Derivation

衍生化/显色4.色谱后衍生化/显色喷雾显色（1g/L，左），浸渍（0.25g/L，右）二氯醌氯亚胺试剂/氨水对辣椒素衍生色谱后衍生化（显色）技术将待测成分可视化，并且使薄层色谱具有了强大的灵活性。喷雾法浸渍法试剂熏蒸碘蒸气–

氨水盐酸热激发反应CAMAG

HPTLC

SOP5.

Records

and

Evaluation记录及评价5.图谱记录和评价客观地对所获得的薄层图谱进行真实的记录是GxP

/

cGMP规范的基本要求，同时也是对分析工作者所

。色谱成像过程中，在不同光源下要尽可能避免肉眼观察和成像图谱之间的差异。固定焦距，固定光圈有助于保证成像的重现性和清晰度。对于GxP/cGMP规范，图谱扫描和成像过程的所有参数必须可溯源并随图像一起保存,并方便对比。TLC-visaulizer

薄层色谱记录系统12位高线性高分辨率工业CCD高重现性：固定焦距、光圈6060KHz高频光源高级图像增强算法可达10s增强的254nm、366nm和白光反射/透射组合图像定量功能（可选）薄层色谱记录系统TLC

VisualizerA.

UV254nmB.UV366nmC.茴香醛试剂衍生化F254F254S有滤光片

无滤光片反射

反射&透射

透射图例.春

油HPTLC

图谱TLC-visaulizer

薄层色谱记录系统自动调整相机，使最亮的斑点亮度最适合调整参数，使感 的区域内最亮的斑点亮度最适合时间自动调节时间手动调节TLC-visaulizer

薄层色谱记录系统标准校正单独校正无校正专业图像增强1：图像校正TLC-visaulizer

薄层色谱记录系统专业图像增强2：空白板扣除扣除空板后点样前的空板展开后的薄层板可以观察到细节！光密度扫描仪TLC

Scanner

4扫描速度高达100

mm/s波长范围190

~

900

nm单波长扫描双波长扫描多波长扫描(可达31λ)单水平校正多水平校正线性工作曲线

多项式标准曲线Michaelis-Menten工作曲线Scanner

4光密度扫描仪成分吸收曲线扫描色谱轨道积分TLC

Scanner

4&WinCATsScanner

4光密度扫描仪TLC

Scanner

4

&

WinCATs多轨道扫描vs.多波长扫描Scanner

4光密度扫描仪CAMAG

HPTLC

SOP应用实例应用实例—样品及色谱条件样品：随机采购并选择13种不同油墨颜料成分的笔芯提取：ISO12757书写检测用纸,10mm,

MeOH/Water

(1:1)(v/v),

2hr,Room

Temp.（22℃）；薄层板：Silicagel

60

HPTLC,MeOH预洗，110℃，20min活化；点样：条带长度4mm，原点距离10mm，距板边缘距离15mm，轨道数18；展开系统：1-butanol/ethanol/water/acetic acid

(60:10:20:0.5)

(v/v)；展距：55mm

(1h)结果检视：成像/扫描应用实例—定性鉴别应用实例—定性/定量200

~

900

nm17

nm/step多波长扫描(多达31λ)Identification

of

various

resinsTrackSampleVolumeTrackSampleVolume1Thymol

and

anethole百里酚和茴香脑2

µL12Tolu

Balsam香脂2

µL2Dammar

gum达玛树脂2

µL13ToluBalsam香脂2

µL3Dammar

gum达玛树脂2

µL14Boswellia

serrata齿叶乳香树脂2

µL4Dammar

gum达玛树脂2

µL15Boswellia

serrata齿叶乳香树脂2

µL5Benzoe

tonkinensis越南安息香2

µL16Boswellia

serrata齿叶乳香树脂2

µL6Benzoe

tonkinensis越南安息香2

µL17Myrrh没药，热带树脂5

µL7Benzoe

tonkinensis越南安息香2

µL18Myrrh没药，热带树脂5