病理组织切片的制作

病理组织切片的制作卢文丽吴中华方肇勤（2007/01/04）一、 器材（按一小组，约4-6人）眼科镊：直无勾10cm、弯无勾10cm各5把；组织镊；12.5cm2把；眼科剪：直尖10cm4把；解剖剪：cr/14，4把；普通双面刀片：10片/盒X1盒；染色架：5个；染色缸：1000ml，14-15个；切片盒：50片/盒乂3盒或100片/盒X2盒；37度、60度恒温箱：各1个；磨砂载玻片：50片/盒X3盒；盖玻片：100片/盒X2盒；广口瓶：30ml或60mlx20个；滴管及配套吸头：4个；玻璃漏斗：p903个；玻璃搅棒：2支普通粗孔大张滤纸：20张；p90mm玻璃培养皿：4个；中号普通毛笔：2支；烧杯：500ml、1000ml各1个；量筒：100ml、500ml、1000ml各1个；组织切片机及配套刀片：4台；摊片用水浴锅：2台；生物切片石蜡：5盒，熔点：56-58^；电子天平：1台；酒精灯：150ml,4台；脱水篮：1-2个；打火机、标签纸、铅笔各一，卷筒纸、乳胶手套、口罩、医用纱布足量。试剂苦味酸（2.4.6-三硝基苯酚）：30g/瓶X1瓶；37%〜40%福尔马林液：500ml/瓶X1瓶；冰醋酸：AR,500ml/瓶X1瓶；无水乙醇：AR,500ml/瓶X10瓶；二甲苯：AR,500ml/瓶X10瓶；hematoxylin苏木色素（苏木精）：10g/瓶X1瓶；酸性品红（曙红丫水溶）：25g/瓶X1瓶；碘酸钠：AR,500g/瓶X1瓶；柠檬酸：AR,500g/瓶x1瓶；水合氯醛：AR,250g/瓶x1瓶;铵矶（ALNH（SO）-12HO）或钾矶（ALK（SO）-12HO）：500g/瓶x1瓶蛋白甘油（甘油/鸡蛋清=1/1）：50ml中性树胶：100&/瓶乂2瓶。若中性树胶过于粘稠，可与二甲苯按7/3的比例稀释。蒸馏水：5000ml

三.实验步骤（一）固定液、染色液的配置（1）Bouin氏液苦味酸饱和水溶液75ml37%〜40%福尔马林液25ml冰醋酸5ml苦味酸饱和溶液的浓度为100ml水中加1g苦味酸。（2）Mayer苏木精液苏木精1g蒸馏水1000ml铵矶或钾矶50g碘酸钠0.2g柠檬酸1g水合氯醛50g将苏木精溶于蒸馏水内（需要时可微热），加入研细的明矶，摇震助溶（需要时再加温），明矶溶解后，依次加入碘酸钠、柠檬酸、水合氯醛等试剂。配制后即可供使用。（3）曙红曙红 0.5〜1g蒸馏水 100ml混匀后过滤（二） 组织取材取舌、胸腺、脾、胃、肝、十二指肠等6种脏器。（三） 固定与修块上午：取组织块入Bouin氏液中，组织块的直径应小于7mm。下午：修块，用双面刀片将组织块修剪成3〜5mm3大小。若中午取材，则晚上修快。具体修块方法如下表1：表1舌等6种组织修块及包埋方法组织名称修块方法包埋方法舌在舌根隆起靠舌尖侧切断，分为四段，取前2/4段舌体近舌尖部朝下肝截取4mm3大小方形块任一截面朝下脾截取中间4mm3大小方形块截断面朝下胃截取幽门部朝上长约5mm的胃胃窦部宽口朝下十二指肠靠近幽门部截取长约5mm的肠截断面朝下胸腺截取5mm3大小方形块任一截面朝下（四）脱水与透明在以下过程，要求经常晃动组织块，以保证组织块可以充分地与乙醇或二甲苯接触，在每一步骤之后，要充分滤干组织块，一般用筒纸吸干组织块上的液体，以免影响其他液体的浓度，但要防止组织块干燥。全过程约需要4.5h（270min）o1.75%乙醇 50minTOC\o"1-5"\h\z85%乙醇 50min95%乙醇（I） 30min95%乙醇 （II） 30min100%乙醇（I） 30min100%乙醇（II） 30min7 1/2二甲苯（乙醇与二甲苯等体积）20min二甲苯（I） 20min二甲苯（II） 10min（可依据透明效果而定）透明效果的判断：如组织块颜色加深透明，二甲苯溶液颜色透明，即表明脱水效果很好；如脱水不好，二甲苯溶液颜色会变混浊。使用过的酒精或二甲苯倒入烧杯里以便回收。（五） 浸蜡、包埋与修蜡块浸蜡：可在脱水与透明进行时，将60。0恒温箱打开，使大烧杯内的石蜡充分溶解，待脱水与透明结束后，可将脱水篮整个或包裹在纱布内的组织块转入充分溶解的石蜡里，于60°C恒温箱放置120分钟。包埋：包埋有多种器具，比较简洁廉价的方法是采用纸盒。可在浸蜡的同时将纸盒做好，包埋时将60C的石蜡倒入纸盒内，然后用小镊子将各组织块按一定的顺序排列好，使切面朝下。我们建议，不同组别的同一组织包埋于一个蜡块中，以保证切片和染色条件一致，且以便读片和比较。为防止倒入纸盒内的石蜡底部立刻凝固，可将纸盒置于一玻璃板上（或大培养皿内），然后将玻璃板置于80-90C左右热水上，包埋时蜡盒底部要放平，做蜡块的蜡要反复冻融较好。组织包埋方法可参见表2。修蜡块：待纸盒内蜡凝固后（若需要使蜡块迅速凝固，可将包埋好的蜡块置于4。。冰水混和物中）。将蜡块取出，用刀片将其修成梯形，通常蜡块大小视组织多少而定，为保证切片顺利，组织块与蜡块边缘之间的距离不得小于2mm。修剪下来的残蜡应回收，以便再用。（六） 切片在载玻片上擦少量甘油蛋白。可滴半滴甘油蛋白于载玻片上，用手指充分抹匀，呈半干状为佳。切片厚约4〜8pm，通常厚约6gm，细胞小而密的组织如胸腺，可以切4〜5pm，而细胞疏的组织，如下丘脑可切10pm。将切片在55C左右水浴中展开，展开程度以带黄颜色的组织完全摊平为准。用涂有甘油蛋白的载玻片从水浴中捞取切片，斜放在木架上，立即放入37C烘箱中过夜，一般时间越长效果越好，以切片紧贴于载玻片上呈半透明状为佳。每个组织块捞片2张。过夜后，将载玻片置于玻片架上，进行下面的实验。（七） 脱蜡、染色与脱水取出玻片架后，应将玻片架倾斜，以使载玻片上的试剂流尽，然后用筒纸将玻片架和载玻片下缘的试剂吸干，以免影响其他试剂的浓度。全过程约需要50min。脱蜡到水（1） 二甲苯（I） 15分钟（2） 二甲苯（II） 15分钟（3） 100%乙醇 2分钟（4） 95%乙醇（I） 1分钟（5） 95%乙醇（II） 1分钟（6） 蒸馏水浸洗 1分钟染色（7） 苏木精 30秒钟自来水冲洗1分钟，但应注意不能用水直接冲在玻片上，以免冲走切片。(显微镜下观察效果)伊红(着色即可) 10秒钟蒸馏水浸洗 1分钟脱水95%乙醇(I) 1分钟95%乙醇(II) 1分钟100%乙醇 2分钟二甲苯(I) 2分钟二甲苯(II) 3~5分钟封片将载玻片从玻片架上取下，滴加1~2滴中性树胶，用眼科镊夹住盖玻片的一角，轻轻盖上盖玻片，让中性树胶沿着盖玻片充分展开，之后倾斜载玻片，用筒纸将多余的中性树胶吸干，同时注意避免有气泡的产生，平放载玻片，室温下长期保存。参考文献：杜卓民主编.实用组织学技术［M］.第2版，北京:人民卫生出版社,1998［英］C.F.A卡林著，孔庆雷译［M］.组织病理学和组织化学技术手册.北京:科学出版社,1982附：中医学综合实验病理组织切片制作时刻表组织取材、固定：第1天上午或中午组织修块、固定：第1天下午或晚上组织脱水、透明、浸蜡、包埋、切片：第2天全天TOC\o"1-