生物皮肤组织知识教案

83/83第一章结缔组织染色结缔组织广泛分布于人体和动物体内，其结构特点是细胞分散，有大量的细胞间质纤维和基质，而化学成分是含有大量的蛋白质和多糖。结缔组织一般分为固有结缔组织（其中包括疏松、致密和网状结缔组织等）、软骨组织和骨组织。第一节结缔组织多色染色法一、Mallory三色染色法试剂配制（1）重铬酸钾液重铬酸钾2.5g，醋酸5ml，蒸馏水95ml（2）苯胺蓝桔黄G液苯胺蓝0.5g，桔黄G2g，磷钨酸1g，蒸馏水100ml（3）酸性复红液酸性复红0.5g，蒸馏水100ml2.染色步骤（1）中性甲醛液固定组织，石蜡切片，常规脱蜡至水。（2）重铬酸钾液10min。（3）蒸馏水冲洗2min，蒸馏水2次。（4）酸性复红液2min，蒸馏稍洗。（5）苯胺蓝液20min，95%乙醇快速分化。（6）直接用无水乙醇脱水，二甲苯透明，中性树胶封固。3.结果胶原和网状纤维呈蓝色，软骨、粘液、淀粉样变物质呈淡蓝色，神经胶质纤维、肌纤维和酸性颗粒呈红色，髓鞘和红色呈桔红色。4.注意事项（1）酸性复红液易溶解于水，肉眼观看切片上保留一定的红色。（2）苯胺蓝液染色后，用95%乙醇分化时，须用显微镜观看掌握。（3）对陈旧的固定标本，其染色效果较差，可增加染色时刻。（4）另张切片，可同时作胶原纤维对比染色而进行鉴不组织成分。二、Masson三色染色法1.试剂配制（1）Masson复合染色液酸性复红1g，丽春红2g，桔黄G2g，0.25%醋酸300ml。（2）亮绿染色液高绿SF0.1g，0.2%醋酸100ml。2.染色步骤中性甲醛液固定组织，石蜡切片，常规脱蜡至水。（1）Masson复合染色液5min。（2）0.2%醋酸水溶液稍洗。（3）5%磷钨酸5-10min。（4）0.2%醋酸水溶液浸洗2次。（5）亮绿染色液5min，0.2%醋酸水洗2次。（6）无水乙醇脱水，二甲苯透明，中性树胶封固。3.结果胶原纤维呈绿色，肌纤维呈红色，红细胞呈桔红色。4.注意事项（1）Masson复合染色液，经磷钨酸分化时须用显微镜操纵肌纤维清晰为止。（2）亮绿染料可用苯胺蓝替换，可用来作为对比观看染色的效果。三、显示胶原纤维、网状纤维和弹力纤维的三联染色法（1993年）1.试剂配制（1）高锰酸钾硫酸液0.5%高锰酸钾水溶液中加入5ml的硫酸。（2）维多利亚蓝染色液维多利亚蓝2g，糊精0.5g，间苯二酚4g，蒸馏水200ml。将上述物质混合后加热煮沸，边煮边搅拌，约5min。然后用另一容器取30%三氯化铁水溶液25ml，另行加热煮沸后慢慢倒入上述混合液中接着煮沸3min，不断搅拌溶液呈胶体状。去火冷却过滤，将滤纸上的残渣连同滤纸放在60℃恒温箱中烤干。残渣呈深蓝色细颗粒状粉末，再溶于400ml的70%乙醇液中。然后加浓盐酸4ml和苯酚5g放置至成熟后使用。（3）丽春红染色S染色液0.5%丽春红S水溶液15ml，苦味酸饱和水溶液85ml。（4）Gomori氨性银改良液取5%硝酸银水溶液5ml，滴加浓氨水由棕黑色变清为止，再加入3%氢氧化钠水溶液5ml，现在该液突变紫黑色，这时再加入氨水使之变清晰为止。最后用蒸馏水补足至50ml，盛棕色试剂瓶中，置于冰箱中备用较长时刻。2.染色步骤（1）中性甲醛液固定组织，石蜡切片，常规脱蜡至水。（2）高锰酸钾硫酸液氧化3min后，自来水浸洗后，用2%草酸漂白2min。（3）5%硫酸铁铵1min。（4）Gomori氨性银改良液染1min。（5）蒸馏水洗2次，用15%甲醛液还原1min。（6）蒸馏水洗2次，0.2%氯化金30s，蒸馏水洗1次。（7）70%乙醇浸一次，再浸入维多利亚蓝液中染30min-1h。（8）95%乙醇分化1min左右。（9）浸入蒸馏水中1min后，用丽春红S染色液染色2min。（10）直接用无水乙醇脱水，二甲苯透明，中性树胶封固。3.结果胶原纤维呈红色，网状纤维呈黑色，弹力纤维呈绿色，肌肉和红细胞呈淡黄色。4.注意事项氨性银液滴染时，要用洁净吸管，防止银液污染而发生沉淀。氨性银液作用后的切片不能倾倒，应将蒸馏水冲洗切片上的银液，如此就可不能使银液表面挥发的银颗粒而沉积在组织上。第二节胶原纤维一、胶原纤维的分布和组成成分胶原纤维是结缔组织中的三种纤维之一，分布最为广泛，含量最多。要紧分布于真皮、键、韧带、骨、透明软骨、动脉、肠壁、子宫和基底膜等，胶麻纤维具有韧性大，抗拉力强的特点。在弱酸或沸水中可慢慢溶化成胶水，称白明胶。胶原纤维和网状纤维的差不多构造相似，都以胶原单位(蛋白质为主的大分子)为差不多单位。胶原单位接连和融合形成网状纤维;它是粗约1μm左右的分支状纤维，形成全身组织的支架，在HE染色中看不清晰。但其不处裹着的一层类蛋白，凭借镀银法能够清晰地显示出来，故又称为嗜银纤维。胶原纤维单位要紧由纤维母细胞合成。其他如平滑肌细胞等也能产生。胶原单位的形成开始于细胞的粗面内质网，合成比构成胶原单位的α肽链更长的前α肽链，经高尔基体分泌出细胞，在细胞外液的内切肽酶作用下，切去前α肽链的附加肽段而形成胶原单位；再经细胞外液的赖氨酰氧化酶作用使两条肽链通过醛醇或醛胺缩合构成共价交联。如此胶原单位分子之间就形成了稳定的联系，形成胶原微纤维，然后再聚合而成胶原纤维。二、胶原纤维染色的应用胶原纤维染色在病理诊断上要紧用于鉴定梭形、纤维形细胞肿瘤的组织来源：常常要在纤维、平滑肌和神经三者之中作出选择。还能使用于其他的情况下，如观看动脉硬化的心脏，在HE切片中，心肌内散在的小疤痕灶和心肌均被染作红色，而作胶原纤维染色可将胶原组织和心肌组织明显地区分开来。早期肝硬化用胶原纤维染色，也可使小叶之间少量增生的胶原纤维突出地显示出来。由干胶原纤维是由成纤维细胞产生的一种纤维蛋白成分，常常被酸性染料染色。l.VanGieson苦味酸酸性复红法(1889年)[试剂配制](l)VanGieson液l%酸性品红水溶液10ml，苦味酸饱和水溶液(约l.22%)90ml。(2)Weigert铁苏木素溶液甲液：苏木素lg,95%或无水乙醇100ml；乙液：29%三氯化铁水溶液4ml，蒸馏水95ml，盐酸lml。临用时取甲液和乙液等量混合即可。铁苏木素不能像明矾苏木素一样配制后放置，因铁与染色剂的色素可引起化合而形成不溶性沉淀。因此，以铁作为媒染液时，必须与染液分不配制、分不应用或临时混合应用。[染色方法](1)组织固定于10%甲醛液，常规脱水包埋。(2)组织切片脱蜡至水。(3)用Weigert苏木素液染5~l0min。(4)自来水冲洗数分钟。(5)依照染色的深浅可用0.5%盐酸乙醇分化。(6)自来水洗至变蓝；用蒸馏水洗。(7)用VanGieson液染1~5min。(8)倾去染液，直接用95%乙醇分化和脱水。(9)无水乙醇脱水，二甲苯透明，中性树胶封固。[结果]胶原纤维呈红色，肌纤维、胞质及红细胞黄色，胞核呈黑色。[注意事项](1)目前以苦味酸、复红的VanGieson染液直接染此一种溶液即可。(2)Weigert铁苏木素分甲、乙两液，应于临用前将两液等量混合使用，而不宜预先混合，否则易氧化沉淀而逐渐失其染色能力。(3)VanGieson染色液分不在临用时混合，防止放置时刻长，则酸性品红不易着色。2.Siriured染色法这种方法可使胶原纤维长期保存，是不易褪色的一种好方法。[试剂配制](l)Siriusred饱和苦味酸液0.5%Siriuredl0ml，苦味酸饱和液90ml。(2)天青石蓝液天青石蓝B1·25g，铁明矾1.25g，蒸馏水250m1。溶解煮沸，待冷过滤后，加入甘油30m1，然后再加入浓盐酸5ml。[染色方法](1)组织固定于10%甲醛液，常规脱水包埋。(2)切片脱蜡至水。(3)入天青石蓝液染5~10min，(4)蒸馏水洗多次。(5)Siriured饱和苦味酸液染15~30min。(6)无水乙醇直接分化与脱水。(7)二甲苯透明，中性树胶封固。[结果]胶原纤维呈鲜红色，细胞核绿色，其他为黄色。3.Lillie改良VanGieson法(1965年)[试剂配制]A.用1%醋酸配成0.1%快绿FCF液，或为得到较蓝的绿色用3%毛绿S(WoolgreenS)。B.且0.2%酸性复红，0.2%紫胺(Violamine)或用0.1%~0.5%丽春红S(ponceauS)溶于饱和的苦味酸水溶液。[染色方法](1)按常规将切片脱蜡至水。(2)用Harris明矾苏木素液染3min。(3)自来水洗，盐酸乙醇分化数秒钟。(4)自来水洗至显蓝，蒸馏水洗。(5)在A溶液中染4min。(6)在1%醋酸中洗2次。(7)在B溶液中染l0~l5min。(8)在1%醋酸中洗2min。(9)无水乙醇脱水，二甲苯透明，中性树胶封固。[结果]结缔组织红色，肌肉、胞质灰绿色，红细胞绿色，核蓝黑色。4.Clark改良VanGieson台盼蓝法(1971年)用于胶原纤维、包括特不细的纤维，以及肌肉角化上皮的染色。[固定]甲醛固定液。[试剂配制](l)A液0.3g萘酚黄S（naphtholyellowS）溶窜犯100mI蒸馏水。(2)B液0.2g酸性复红溶于100ml蒸馏水中。(3)C液0.2g台盼蓝溶于100ml蒸馏水中。染色液由40份A溶液，2.5份B溶液和2份C溶液组成。每40分A溶液加入，0.4ml浓盐酸。[染色方法](1)石蜡切片，脱蜡至水(2)在Weigert铁苏木素中5ml。(3)自来水洗。(4)在染色液中染l0min。(5)在水中迅速洗一下即通过50%、70%与95%乙醇，无水乙醇两次。(6)二甲苯透明，中性树胶封固。[结果]核-蓝黑色；胞质-黄色，胶原纤维-粗纤维红色，细纤维蓝色。[讲明]本法中的Weigert铁苏素液染色，可改用棓花青-铬矾溶液中染16h。5.Biebric猩红染色法Lillie，1965年[显示目的]胶原纤维、网状纤维、肌肉、胞质。[固定]甲醛液，Orth液。[试剂配制](l)A液Weigert铁苏木精，见苦味酸酸性复红法。(2)B液0.2gBiebrich猩红溶于100ml1%醋酸。(3)C液0.1g苯胺蓝溶示100ml饱和苦味酸水溶液。[染色方法](1)常规脱蜡至水。(2)在A溶液中染5min。(3)自来水冲洗。(4)在B染液中染4min。(5)自来水洗。(6)在C染液中染5min。(7)直接移入1%醋酸中3min。(8)无水乙醇脱水，二甲苯透明，中性树胶封固。[结果]结缔组织蓝色，肾小球基质蓝色，网状纤维蓝色，红细胞橙红至猩红色，肌肉粉红色，胞质粉红色至灰色，核黑蓝色，粘液浅蓝色。6.苦味酸氨基黑染色法Li1lie，1965年[显示目的]胶原纤维、网状纤维、基膜、肾小球基质。[固定]任何固定剂均可。[试剂配制](l)A液煌紫素R(BrilliantpurpurinR)0.6g；偶氮复红G(azo-fuchsinG)0.4g；冰醋酸1ml，蒸馏水加至100m1，上述两种染料先各自用1%醋酸配成1%溶液，以6﹕4比例混合后再用。(2)B液氨基黑10B，5~100mg；苦味酸饱和水溶液100m1。同样浓度的苯胺蓝或甲基蓝均可用来代替氨基黑(又称蔡酚蓝黑)，粘液可得到较好的显示。[染色方法](1)切片常规脱蜡至水。(2)在Weigert铁苏素中染6min。(3)自来水洗。(4)在A染液中染5min。(5)流水中洗。(6)在B染液中染1~5min。(7)在1%醋酸中分色2min。(8)无水乙醇脱水，二甲苯透明，中性树胶封固。[结果]胶原纤维、网状纤维和基膜深绿色；粘液深绿色，上皮细胞胞质棕色，肌肉浅绿色，红细胞红色。7.Petersen酸性茜蓝改良法[显示目的]胶原与网状组织、骨铬肌、心肌横纹、心肌间板。[固定]Zenker液，Helly液、Bouin液或甲醛液。[试剂配制](1)A液即缓冲的酸性茜蓝溶液。酸性茜蓝2B，0.25g；硫酸铝5g；蒸馏水50m1。煮沸5min。冷却，过滤，再补足到原来的体积。然后加20ml的Sorensen柠檬酸盐溶液(柠檬酸晶体21g，lNNaOH，200m1。加蒸馏水至1000ml)和30ml0.lN盐酸缓冲到pH为2.25。(2)B液即苯胺蓝橘黄G溶液。苯胺蓝0.5g;橘黄G，2g；蒸馏水100ml，冰醋酸8ml，煮沸，冷却，过滤。[染色方法](1)常规石蜡切片，脱蜡至水。(2)在A液中染3min。(3)在蒸馏水中快速洗2次。(4)在5%磷钨酸液中分色并媒染2~3min。(5)蒸馏水洗。(6)在未经稀释的B液中染2~3min。如染色结果太深，可用1、2或3倍体积的蒸馏水稀释。(7)蒸馏水中略洗。(8)先用95%乙醇后用无水乙醇脱水。(9)二甲苯透明，中性树胶封固。[结果]胶原与网状结缔组织蓝色，染色质砖红色，肌组织依照所用不同品种的固定剂染色从深品红色至亮橙色，红细胞橙红色，粘液淡蓝色，神经节细胞淡品红色，腺细饱依照其组成从浅蓝色至品红色。8.显示胶原纤维、细胞和肌肉的新染法[固定]中性甲醛液，石蜡切片。[试剂配制](1)Ponceau's染色液0.5%Pohceau's(丽春红S，上海试剂三厂)水溶液l0~15ml，苦味酸饱和水溶液85~90ml。(2)Victoriablue'B染色液Victoriablue'B(维多利亚蓝，B，上海试剂三厂)0.5g，70%乙醇100m1。[染色方法](1)组织切片脱蜡至水。(2)70%乙醇稍洗后，入Victoriablue'B染色液中l5min。(3)95%乙醇中分化数秒钟。(4)用蒸馏水洗2次。(5)用Ponceau's染色液滴染2min。(6)直接用无水乙醇分化与脱水。(7)二甲苯透明，中性树胶封固。[结果]胶原纤维呈鲜红色，细胞核和血细胞呈绿色，肌肉呈黄色。第三节网状纤维网状纤维是网状结缔组织内的一种纤维。它由网状细胞所产生。网状细胞是一种星状多突的细胞，核大，着色较浅，核仁明显，胞质较丰富，胞突彼此连接形成细胞网架。网状纤维纤细而有分支，穿行于细胞体和突之间，共同构成网状支架。这种纤维用HE染色一般不易辨识。若用银氨溶液浸染能使纤维变成黑色，如又称为嗜银纤维。网状纤维纤细，直径约0.2-1um，没有弹性，而有韧性，能抵抗胃液的消化和弱酸的腐蚀。一、网状纤维染色的应用1.用于显示和鉴不肿瘤的性质和来源（1）显示和区分癌和肉瘤（2）显示和区分血管内皮瘤与血管外皮瘤（3）用以鉴不淋巴细胞肉瘤与网状细胞肉瘤（4）区分骨尤文氏肉瘤与骨网状细胞肉瘤（5）显示与鉴不骨异质增生与骨化性纤维瘤（6）区分软骨粘液纤维瘤与粘液肉瘤（7）鉴不脑膜瘤与星形细胞瘤2.用于某些肿瘤的诊断（1）平滑肌肉瘤（2）纤维肉瘤（3）滑膜肉瘤（4）恶性神经鞘瘤3.用于观看和研究癌组织的发生、进展及其恶性程度。4.显示与观看基底膜的变化。5.用于识不坏死组织的结构及类型（1）凝固性坏死（2）肺结核干酪样坏死6.用于显示和研究肝组织病变。二、网状纤维染色的原理氧化感应浸银还原三、网状纤维染色方法1.Wider染色法（1）固定甲醛液或其他固定液（2）试剂配制氧化银溶液：40%氢氧化钠1滴半10%硝酸银2.5ml取40%氢氧化钠滴入10%硝酸银溶液中立即产生棕褐色沉淀，逐次滴入28%氨水恰好溶化沉淀（一般3滴为宜），用蒸馏水补足20ml。（3）染色次序1）组织切片脱蜡至水。2）10%磷钼酸，2-5min。3）蒸馏水冲洗，5min。4）1%硝酸铀，5s。5）蒸馏水冲洗，10s。6）氧化银溶液，5-10min。7）95%酒精速洗，1-2s。8）还原液还原，1-2s。9）蒸馏水冲洗，2min。10）0.2%氯化金调色，2-20s。11）蒸馏水冲洗，5min。12）5%次亚硫酸钠，2min。13）蒸馏水冲洗，2min。14）核固红染细胞核，5-10min。15）水稍洗。16）常规无水乙醇脱水、二甲苯透明、中性树胶封固。（4）染色结果网状纤维呈黑色、细胞核呈红色。第四节弹力纤维一、弹力纤维的形态特点和组成成分弹力纤维由糖蛋白构成，富含亲水性的极性氨基酸。弹性蛋白提供弹力纤维的弹性，它是一种不溶性蛋白质，当用弱碱处理纤维结缔组织时，其仍然存在。三分之一为甘氨酸，11%为脯氨酸。与胶原纤维不同处为其氨基酸组成中约95%属于非极性疏水氨基酸，锁链赖氨酸(Desmosine)和异锁链赖氨素(lsodesmosine)是弹性蛋白所特有，它们起着共价交联的作用。近年来，电镜下看到组织培养的平滑肌细胞能够合成弹力纤维的两种成分。在没有平滑肌细胞存在时，可能由纤维母细胞形成。弹力纤维广泛分布于躯体各处，特不是在皮肤、血管、壁、韧带、气管、支气管、肺泡、耳廓和腺体的导管处等最为丰富。弹力纤维由两种成分组成，即集合束的弹力微纤维(由糖蛋白形成)和均质状的弹力蛋白。弹力纤维在常规染色中难以区不于其他纤维，只有用专门染色方法，才能清晰地显示出来。近来学者研究认为，弹力纤维系统是由弹力纤维、前弹力纤维和耐酸纤维等三种纤维构成，这三种纤维的分布、走行和组织化学均不相同。耐酸纤维用一般的弹力纤维染色法其着色专门淡，前弹力纤维着色也不够深，但如经强氧化后醛品红或间苯二酚品红法则可把弹力纤维系统中的三种纤维同时显示出来。二、弹力纤维染色的应用(一)显示皮肤组织中弹刀纤维的变化在皮肤组织病变中，特不是真皮内的弹力纤维，时常发生改变，出现增生、卷曲、变性、崩解等，做弹力纤维形成聚拢成堆的束状、团块状及不规则状。见于以下病变①弹力纤维病；②弹力纤维增多症；③弹力过度性皮肤；④皮肤疏松；⑤皮肤环状肉芽肿；⑥肢端角化的弹力纤维变性；⑦硬皮病。(二)显示与判定心血管疾病弹力纤维是心脏和血管的要紧成公之一。(1)显示及鉴不心内膜弹力纤维增生症与心内膜心肌纤维化。这两种病变时心内膜中的弹力纤维和胶原纤维会出现异常增多，在HE-染色中两者的病理变化甚为相似。因此，需要专门染色加以显示与鉴不。(2)显示动脉粥样硬化时硬化斑块底部的内弹力板崩解，断裂乃至消逝情况。(3)显示与观看梅毒性主动脉炎时动脉中层弹力纤维发生灶性破坏的程度。(4)显示高血压时小动脉弹力纤维显著增生以及形成多层的病变特点。(5)用于无脉症，显示在大动脉血管申层弹力纤维密集排列，弹力层增厚。(6)显示老年人动脉变性：动脉的弹力板变性、增厚、断裂、崩解等现象。（三）视察某些病变中的弹刀纤维是否增生与破坏如慢性支气管炎、肺气肿、原发性或继发性肾固缩等，均可导致弹力纤维纵行。散乱、断裂、破坏和增生，形成碎片或颗粒。(四)显示与鉴不肿瘤组织(1)弹力纤维瘤在弹力纤维瘤体的纤维组织中，有许多球状或颗粒状变化的弹力纤维。在HE染色中容易忽略，但用弹力纤维染色，能清晰见到瘤体内丰富的弹力纤维球。(2)乳腺癌见于导管和血管壁周围，这种现象多合并在硬癌和浸润性小叶癌上。如弹力纤维染色法证明在导管癌上，伴随出现弹力纤维增生，可证明是早期浸润癌。三、各种染色方法l、Verhoeff铁苏木素染色法媒染剂三氯化铁和碘配成的苏木素染色液，即Verhoeff铁碘苏木素对弹力纤维有染色力，但没有选择性，它既可染弹力纤维，也可染细胞核和胶原纤维等。通过“染料的分散度和组织的结构密度”以达到分辨不同组织的目的。如弹力纤维和细胞核的结构密度差不多上比较致密的，铁苏木素染液的粒子比较容易地分散到狭孔的弹力纤维或细胞核的间隙中，苏木素粒子在狭孔的弹力纤维中比较密集，因此染色也比较深；而分散到宽孔的胶原纤维间隙中较稀疏，所似染色也比较浅。[固定]105甲醛溶液或其他固定液。[试剂配制]铁碘苏木素液：先将苏本素1g，无水乙醇20ml，进行加温溶解后加入10%三氯化铁水溶液8m1，最后再加入Lugol碘液8ml即可（Lugol液：碘化钾2g，碘结晶lg，蒸馏水100ml）。[染色方法](1)石蜡切片，脱蜡至水。(2)铁碘苏木素液染15~30min，至颜色呈深黑色。自来水洗。(3)2%三氯化铁水溶液分化10~20s，至弹力纤维清晰为止。假如分化过度，可再返回第2步重染铁碘苏木素液。(4)充分水洗。(5)用95%乙醇去碘2~Smin，使黑色纤维更为清晰。(6)水洗，VG复染5min。(7)95%乙醇急速分化。(8)无水乙醇脱水，二甲苯透明，申性树胶封固。[结果]弹力纤维黑色或黑蓝色，胞核黑色，校原纤维呈红色。2、Weigert间苯二酚复红染色法三苯甲烷系碱性染料与雷锁辛和三氯化铁组成一种带有弱正电荷的染料，与结构致密的、富于内表面的弹性纤维通过非极性吸着而完成染色。非极性吸着，是染料不具有强电荷时和组织成分间的结合。确实是讲雷锁辛复红液对弹力纤维的染色。间苯二酚复红液实际上是由碱性品红的铁间苯二酚色淀（Lake)形成的一种复合物，这种复合物与弹力纤维结合，并使弹力纤维着色。其结合的原理不清晰，可能是弹力纤维某些部分与间苯二酚的基团形成氢键。[固定]10%甲醛液及其他固定液。[试剂配制]间苯二酚复红液：碱佳品红1g，间苯二酚2g，蒸馏水200m1，30%三氯化铁1.25ml，浓盐酸2ml。取一个300ml烧杯，放入碱性品红、间苯二酚和蒸馏水，用玻璃棒搅拌，加热煮沸。再慢慢加入30%三氯化铁液，在搅拌下接着煮沸3~5min。冷却后过滤，倾去滤液。将滤纸和沉淀物一同放入烧杯内，置于干燥箱内烘干。取出后加入95%乙醇100ml，在水锅内加热，并不断搅拌至沉淀物完全溶解，取出滤纸，冷却后过滤。补足因蒸发失去的乙醇至100ml。最后加浓盐酸2ml，混合后即可使用。[染色方法](1)石蜡切片，脱蜡至水。(2)在95%乙醇液中浸2min。(3)间苯二酚复红液染1~2h。(4)用95%乙醇液洗去多余染液。假如染色较深可用0.2%盐酸乙醇分化。(5)自来水冲洗2min。(6)用VanGieson液复染lmin。(7)95%乙醇急速分化。(8)无水乙醇脱水，二甲苯透明，中性树胶封固。[结果]弹力纤维深蓝黑色，胶原纤维红色，背景黄色。3、Hart改良间苯二酚复红染色法此法由Weigert法通过改良后进展而来。特点是将Weigert染液用1%盐酸乙醇溶液配制成稀释溶液，进行过夜染色，可显示出较细的弹力纤维。[固定]甲醛固定液和其他固定液。[试剂配制](1)酸性高锰酸钾水溶液0.5%高锰钾水溶液50m1，3%硫酸水溶液2.5m1。此液分不配制，临用时按比例混合使用。(2)Weigert稀释液Weigert原液l0ml，1%盐酸乙醇溶液90ml。此液可保留一定时刻。[染色方法](1)石蜡切片，脱蜡至水。(2)酸性高锰酸钾水溶液氧化5min。(3)自来水洗2~3min。(4)用1%草酸水溶液漂白至无色。(5)充分水洗2min。(6)用70%乙醇液略洗。(7)直接用Weigert稀释液浸染过夜。(8)用1%盐酸乙醇分化数秒钟或直接入95%乙醇液中稍分化。(9)充分水洗5~l0min。(l0)用VanGieson液、1%中性红或HE进行对比染色。(11)95财乙醇及无水乙醇脱水，二甲苯透明，中性树胶封固。[结果]弹力纤维呈蓝黑色，其他组织呈复染的颜色。4、Gomori醛复红染色法醛复红染色液是Gomori在Schiff试剂的使用和实验期间偶然发觉的。醛复红是碱性品红加入三聚乙醛和盐酸配制而成，作为一种酸性催化剂，可使三聚乙醛逐渐解聚产生乙醛。乙醛有较高的活性，释出后与碱性品红染料外露的氨基起反应而产生偶氮甲碱，这时颜色转变为深紫色，是谓成熟，称为醛复红染液。这秧成熟的醛复红对专门的蛋白质及含硫酸根的粘多糖具有专门强的亲合力，和弹力纤维结合专门紧。另外，对肥大细胞颗粒、脂褐素、乙型肝炎表面抗原(HBsAg)、胃主细胞、胰岛的ß细胞和脑垂体的嗜碱细胞，也能专门好着色。[固定]各种固定液，但以甲醛生理盐水液固定的染色效果最佳。[试剂配制](1)醛复红染液碱性复红0.5g，浓盐酸1m1，70%乙醇100ml，三聚乙醛1m1。将碱性复红溶于70%乙醇，然后加入浓盐酸和三聚乙醛，轻轻摇动使混合均匀，于室温下静置1~2日，待变为紫色即为成熟。过滤于小口砂塞瓶，置冰箱内保存备用。(2)橘黄G染色液橘黄G2g，蒸馏水100m1，磷钨酸5g。[染色方法](1)切片脱蜡至水。(2)用Lugol碘液处理5min。(3)稍水洗。(4)5%硫代硫酸钠液处理5min。(5)流水冲洗5min。(6)70%乙醇稍洗。(7)入醛复红液l0min。(8)70%乙醇浸洗2次，每次约30s，至切片不再脱色为止。(9)稍水洗。(10)橘黄G液滴染约1s。(11)蒸馏水洗1~2min。(12)95%乙醇无水乙醇脱水，二甲苯透明，中性树胶封固。[结果]弹力纤维呈深紫色，其他为复染色。[讲明]还可用淡绿橘黄G液、Masson三色液、VanGieson液等复染，但不宜过深。5、Pinkus酸性地衣红-姬姆萨染色法[固定]10%甲醛液、Helly液或Zenker液均可。[试剂配制](1)地衣红染色液地衣红1g，70%乙醇100m1，浓盐酸0.6m1。地衣红溶于乙醇内然后再加入浓盐酸。(2)姬姆萨液取姬姆萨原液5滴，加蒸馏水100ml。(3)伊红乙醇液伊红Y59，95%乙醇100m1，混合后不停搅拌。溶解后即可使用。[染色方法](1)切片脱蜡至水。(2)经70%乙醇漂洗。(3)地衣红液染30~60min。(4)95%乙醇分化，洗去多余染液。(5)用1%盐酸乙醇处理2~5min，直至背景无色为止。需镜下操纵。(6)流水冲洗5~l0min。(7)姬姆萨稀释液浸染2h~过夜。(8)用95%乙醇分化，伊红乙醇液(95%乙醇中滴数滴)中染色，直到大量的蓝色从结缔组织中脱掉为止。可在镜下操纵。(9)无水乙醇脱水，二甲苯透明，中性树胶封固。[结果)细胞核深蓝色，弹力纤维深棕到黑色，胶原纤维粉红到浅蓝色，黑色素呈绿色到棕色，嗜伊红颗粒呈红色至紫色，细胞核呈深蓝色。6、Uana地衣红染色法[固定]甲醛液或其他固定液。[试剂配制]Uana地衣红染色液：地衣红lg,70%乙醇99ml，浓盐酸1m1。将地衣红溶于乙醇内，然后加入浓盐酸。放置冰箱中保存备用。[染色方法](1)组织切片，脱蜡至水。(2)在70%乙醇中2min。(3)置Uana地衣染色液中15~30min(系温箱内所需时刻，室温中浸染过夜)。(4)70%乙醇液分化至无多余染液脱下为止。(5)可用VanGieson液复染。(6)95%乙醇、无水乙醇脱水，二甲苯透明，中性树胶封固。[结果]弹力纤维呈棕红色至暗棕色，其他组织呈复染的颜色。7、Gomori改良醛复红-阿尔辛篮染色法[固定]各种固定液，但以乙醇或Bouin固定液固定效果最佳。[试剂配制]醛复红-阿尔辛蓝染液：盐基性复红0.5g，阿尔辛蓝0.6g，70%乙醇98m1，浓盐酸1ml，三聚乙醛1m1。将复红和阿尔辛蓝依次溶于乙醇内，然后加入盐酸和三聚乙醛，充分混合摇匀，放置室温中24h，使其自然成熟后即可使用。该液用后须贮存于冰箱中可保存2~3个月。[染色方法](1)石蜡切片，脱蜡至水。(2)用醛复红-阿尔辛蓝液染1~2h。(3)70%乙醇液漂洗2次，约3~5min。(4)蒸馏水稍洗。(5)用焰红B液染色10~l5min。(6)直接用无水乙醇脱水，二甲苯透明，中性树胶封固。[结果]弹力纤维呈深紫色，背景呈蓝绿色或其他复染的颜色。8、Darrow合成地衣红改良法(1952年)[固定]Zenker液、Bouin液、10%甲醛均可。[试剂配制](1)A液0.4g合成地衣红溶于100m1含有1%浓盐酸的70%乙醇中。(2)B液即Mallory硼砂亚甲蓝液，其贮存原液为1g亚甲蓝与1g硼砂溶于100m1蒸馏水中。用时将此原液lml加蒸馏水至9ml即可。[染色方法](1)按常规将切片脱蜡。(2)在A液中染30min。(3)在70%乙醇中稍洗2次。(4)蒸馏水中洗2次。(5)在稀释的B液中染5min。(6)蒸馏水洗。(7)在含有0.5%透明松香(Colophony，rosin)的95%乙醇中分色并脱水2min。切片要经常摇动，在镜检下掌握染色结果。(8)在无水乙醇中快速完成脱水，二甲苯透明，中性树胶封固。[结果]弹力纤维呈深紫色或红紫色，核蓝色。9、Fraenkel多色染色法(Lillie，1965年)[显示目的]弹性硬蛋白、胶原纤维、肌肉和核。[固定]任何固定剂。[试剂配制]A溶液：地衣红1.5g，95%乙醇120ml，蒸馏水60ml，硝酸6mI。向含有3%HCl的70%乙醇加入足量的上述贮存液，使溶液呈棕色。B溶液，在饱和的苦味酸水溶液中溶以0.25%的靛姻脂红(Indigocarmine)。C溶液，即Orth锂烟脂红染色液。将2.5~5g烟脂红溶于饱和碳酸锂水溶液中(约1.25%)，煮沸10~15min，冷却过滤并加lg百里蚕粉。[染色方法](1)按常规切片脱蜡至水。（2）用C液染2~5min，使核虽红色。(3)在1%，盐酸乙醇中分色。(4)在A液中染24h。(5)在80%乙醇中分色。(6)在B液中染10~l5min。(7)在3.5%醋酸中洗。(8)在95%与100%乙醇中快速脱水。(9)二甲苯透明，中性树胶封固。[结果]核红色，弹性硬蛋白深棕色，胶原纤维蓝绿色，肌肉黄色。10、碱性蓝B染色法[固定]10%甲醛液、乙醇液或Zenker液均可。[试剂配制](1)碱性蓝B乙醇溶液碱性蓝B0.6~0.8g，70%乙醇100ml。(2)氢氧化钾乙醇液氢氧化钾0.05g，70%乙醇100ml。[染色方法](1)石蜡切片，脱蜡至水。(2)在70%乙醇中lmin，入碱性蓝B乙醇液5~10min。(3)蒸馏水速洗。(4)用4%铁明矾溶液处理2~3min。(5)蒸馏水速洗。(6)入50%乙醇内1~2min。(7)用0.05%氢氧化钾乙醇液分化3~5s。(8)蒸馏水速洗2次。(9)用0.5%荧光桃红液染3~5min。(10)蒸馏水略洗。(11)用95%乙醇及无水乙醇脱水，二甲苯透明，中性树胶封固。[结果]弹力纤维呈蓝色，胶原纤维及背景呈红色，红细胞呈紫红色。11、显示弹力纤维的VBM染色法[固定]中性甲醛固定，石蜡包埋切片。[试剂配制](l)Martiusyellow染色液马休黄0.5g，95%乙醇98m1，磷钨酸0.5g。(2)Victoriablue染色液详见显示弹力、胶原纤维的双重组合染色法。[染色方法](1)组织切片脱蜡至水。(2)切片入70%乙醇中洗2min。(3)将切片浸入Victoriablue染色中2h。(4)用95%乙醇分化lmin。(5)浸入蒸馏水中洗2次。(6)用马休黄染色液染lmin。(7)快速用无水乙醇冲洗2次。(8)二甲苯透明，中性树胶封固。[结果]弹力纤维呈蓝色，背景黄色。12.显示弹力、胶原纤维的双重组合染色法(1992年)[固定]中性甲醛液，石蜡包埋切片。[试剂配制](1)维多利亚蓝染色液维多利亚蓝(Victoriablue)2g，糊精0.5g，间苯二酚4g，蒸馏水200m1。将上述物质混合后加热煮沸，边煮边搅拌，约5min。然后用另一容器取30%三氯化铁水溶液25ml，另行加热煮沸后慢慢倒入上述混合液中，接着煮沸3min，不断搅拌溶液呈胶体状。去火冷却过滤，将滤纸上的残渣连同滤纸一起放在60℃恒温箱中烤干。残渣呈深蓝色细颗粒状粉末，再将其溶于400m1的70%乙醇液中。然后加浓盐酸4ml和苯酚5g，放置至成熟后使用。(2)丽春红S染色液0.5%丽春红(ponceau's-上海试剂三厂出品)l5ml，加苦味酸饱和水溶液(1.22%)85m1。[染色方法](1)组织切片脱蜡至水。(2)切片入70%乙醇中洗2min。(3)将切片浸入盛有维多利亚蓝液中染0.5~2h。(4)直接入95%乙醇中分色数秒钟。(5)用蒸馏水洗2min。(6)用丽春红S液滴染切片2min。(7)直接用无水乙醇冲洗多余染色液2次。(8)将切片在空气申或冷风干燥。(9)二甲苯透明，中性树胶封固。[结果]弹力纤维呈蓝绿色，胶原纤维呈红色，背景呈淡黄色。第二章肌肉组织肌组织要紧由肌细胞构成，依照结构和功能，又分为骨骼肌、心肌和平滑肌，而骨骼肌和心肌的肌纤维含有横纹，因此又称为横纹肌。其差不多病变要紧是指肌纤维的变性、坏死和修复等。常见肿瘤有横纹肌瘤、横纹肌肉瘤和含有成肌细胞的混合性中胚叶肿瘤等，而共同的病理变化特点是肿瘤细胞可出现横纹肌纤维，可用磷钨酸苏木素（PTAH）来显示肌纤维成分。第一节横纹肌组织一、Mallory磷钨酸苏木素染色法（PTAH）1.试剂配制（1）Mallory磷钨酸苏木素液（PTAH）苏木素0.1g，磷钨酸2g，蒸馏水100ml。将苏木素置20ml蒸馏水中加热溶解，再将磷钨酸溶于80ml蒸馏水中。苏木素冷却后加入磷钨酸溶液，混合后置放，经阳光处理数周至数月才成熟。（2）高锰酸钾氧化液0.5%高锰酸钾水溶液50ml，0.5%硫酸水溶液50ml。2.染色步骤（1）中性甲醛液固定组织，石蜡切片，常规脱蜡至水。（2）在高锰酸钾液中氧化5-10min。（3）自来水洗2次后，用1%草酸漂白2min。（4）自来水洗，蒸馏水洗2次。（5）浸入MalloryPTAH液中12-48h。（6）直接用95%乙醇分化。（7）无水乙醇脱水、二甲苯透明、中性树胶封固。3.染色结果胞核、纤维、肌肉、神经胶质纤维、纤维素、横纹肌等均呈蓝色；胶原纤维、网状纤维、软骨基质及骨呈黄色或玫瑰红色；粗弹力纤维有时被染色成微紫色；有缺血缺氧早期病变的心肌呈紫蓝色或棕黄色。4.注意事项（1）此液在室温下自然成熟后，置冰箱内保存可使用多年时刻，其效果不减。（2）假如实验时急需用试剂，可在PTAH染色液中加入0.15g的高锰酸钾，以加快促使成熟。（3）95%乙醇分化时应注意在切片上保留一定的红色，然后用无水乙醇快速脱水，冷风稍干燥后封固。第二节早期心肌病变组织染色早期心肌梗死是近年来被称为早期心肌病变，从60年代开始，有许多作者都对心肌病变进行方法学研究，其共同特点是选用酸（碱）性复红对缺氧心肌进行实验，结果证明了心肌病变的可靠性，这种缺氧心肌对酸性复红的亲和力称嗜复红性，对碱性复红的亲和力称为亲复红性。在实验中还可用PAS法来显示早期心肌病变中的糖原减少或消逝。以便作为对比的鉴不诊断。一、Nagar-Olsen染色法（1974年）此法显示缺氧心肌的苏木素碱性复红苦味酸染色法，简称HBFP。1.试剂配制（1）Harris苏木素液（2）碱性复红染色液碱性复红0.1g，蒸馏水100ml。2.染色步骤（1）中性甲醛液固定组织，石蜡切片，常规脱蜡至水。（2）入明矾苏木素液10-30s。（3）自来水冲洗5min，用蒸馏水洗2次。（4）碱性复红染色液3min。（5）蒸馏水洗5-10s。（6）纯丙酮洗5s。（7）0.1%苦味酸纯丙酮液迅速分化5-15s。（8）纯丙酮脱水、二甲苯透明、中性树胶封固。3.染色结果缺氧心肌、红细胞呈红色，正常心肌呈黄色或黄棕色，细胞核呈黄色。4.注意事项本法属于退行性染色，关键是在苦味酸丙酮液中分化，复红液对缺氧心肌染色力较强，而分化时也相对的抵抗力较大，其脱色慢些；但正常心肌对分化液的抵抗力差，即脱色快些，因此需要将切片浸入分化液中而不停的快速上下移动多次后，即用丙酮进行脱水，在镜下观看脱色情况，假如分化不足可再进行分色。第三章神经组织第一节神经元及神经纤维一、神经元及神经纤维的结构神经组织要紧是由具有长突起、能传导冲动的神经细胞组成。神经细胞是神经系统的结构和功能单位，因此又称神经元。神经元集中于大脑、小脑皮质、脑干、脊髓的灰质以及神经节内。神经元的胞体聚拢成核团，而神经元的轴突组成纤维束；在周围神经中，神经元的胞体组成神经节，轴突组成神经束。神经元由细胞体、树突和轴突构成。神经元的细胞体具有和其他细胞一样的结构，即表面有细胞膜、中有细胞质、内有细胞核。胞体的形态、大小各异，有圆形、锥形、星形等。一般细胞核位于胞体的中央，为泡状，核仁极明显；胞质结构较复杂，含有神经原纤维、尼氏小体、高尔基体、线粒体、内含物、色素等，其中神经原纤维和尼氏小体是神经元特有的结构。神经元之间通过突触互相联系。神经元的胞突分为树突与轴突两种。每个神经元有1至多个树突，轴突只有一个。神经纤维由从神经元发出的轴突和较长的树突以及包裹在外的构造一起组成，在脑与脊髓内走行于白质中，并为外周神经系统的一部分。轴突中要紧为神经原纤维和少量胞浆及线粒体，没有尼氏小体。轴突外周的构造，有些较为复杂，外层被鞘膜包裹，称为有髓纤维；有些比较简单，无鞘膜被覆。称为无髓纤维。二、神经元和神经纤维的染色在常规HE染色中尽管可观看到神经元及神经纤维的全貌，然而细微的结构和某些专门成分还需用专门的染色方法来显示。用镀银法能够在神经元胞浆中看到许多交错成网的细丝，并伸入树突之中，这在HE染色中是看不到的。电镜下可见它们是粗约120Å的微丝或直径约250Å的微管集合成的束。神经原纤维可能与维持细胞的外形和细胞内物质的传递有关。某些疾病时，神经原纤维集结，可用镀银染色清晰地显示。在神经组织的疾病诊断和科研中，均需要应用显示神经元及神经纤维的染色方法进行观看。如一些中毒性外围神经疾病、维生素B1缺歹症、麻风病及其他外周神经病变时，可用专门染色法来进行观看损害程度。当神经纤维遭受横断外伤时，神经纤维可发生变性、崩解、自断端向两侧进展，严峻者导致溃变，神经原纤维肿胀、碎裂，继而成为颗粒状。神经元及神经纤维染色在诊断和鉴不某些神经系统肿瘤方面也经常应用。神经元和神经纤维的染色法较多，但要紧为镀银法。镀银法的差不多原理是把固定后的组织或切片浸于银溶液中，再用还原剂处理，使银颗粒沉着于轴索的轴浆中，使之呈现深棕色或黑色。镀银后可在神经元胞浆内看到许多交错成网的细丝，并伸入树突及轴突之中。1．Bielschowsky冰冻切片法引自Davenport，Windle与Beech(1934年)和Beech与Davenport(1933年)，原由Bielschowky(1904年，1909年)所作。【显示目的】神经细胞及其突起，神经原纤维。【固定】10%甲醛液。【试剂配制】氨银液：于20%硝酸银溶液5ml中加入6滴40%氢氧化钠液。逐滴加入浓氨水，边滴边摇荡，使沉淀刚刚溶解，再加蒸馏水稀释至总量为25m1，过滤后备用(放在冰箱中保存)。【染色方法】(1)新奇小块组织固定时刻为24~48h。(2)流水冲洗24h。(3)冰冻切片，厚度l0μm(神经原纤维)或15~20μm(细胞和轴突)。(4)切片用蒸馏水洗1h，多次换水。(5)切片移至，一小碟4%硝酸银液内，置于暗处24~48h。切片应在液内平展，勿有皱褶。(6)蒸馏水速洗。(7)用新配的上述氨银液处理2~10min。直至切片从淡褐色变为深烟草褐色。(8)蒸馏水速洗两次。(9)移至10%甲醛水溶液内5~10min，使银还原。(10)蒸馏水洗2~3次约5~10min。(11)用0.2%氯化金调色10~15min。(12)蒸馏水洗。(13)移至5%硫代硫酸钠液内5min。(14)自来水洗。(15)附贴于清洁载玻片上，脱水、透明、常规封固。【结果】神经细胞(和神经原纤维)、轴突和树突褐至黑色。【注意事项】第(11)调色步骤可用或不用。欲使背景清晰和神经元着色较深，一般多采纳之。2．Bielschowsky组织块染法【固定】10%甲醛液。胚胎用10%甲醛液中加0.25%~0.5%三氯醋酸液固定。【试剂配制】(1)A液1.5gAgNO3溶于100ml蒸水中。(2)B液5mlNH4OH(浓)与40ml2%NaOH混合。边摇动边用一滴定管或刻度吸管加入足量的8.5%AgNO3使溶液，使之产生轻微的恒定的混浊。再加3~5滴NH4OH(浓)，达到终点时AgNO3的用量应为35~45ml。【染色方法】(1)组织固定后在水中洗lh左右。(2)放在纯吡啶中，胚胎组织则放入吡啶与蒸馏水等分混合液中，l~2日。(3)依照组织块大小，在水中洗2~6h。(4)放在A液中，37℃约3日。(5)水洗20min至1h。(6)在B液中浸染6~24h。(7)在水中洗15min至数小时(通过水洗会使后述的染色变浅)。(8)在1:100甲醛液还原1~12h。(9)自来水洗。(10)组织脱水、透明、浸蜡包埋和切片，裱于载片上。(11)用二甲苯脱蜡后盖片封固；或将切片脱蜡至水，用氯化金调色；假如染色太浅，可在Bodian的蛋白银中重染。【结果】未调色者，神经纤维与神经原纤维棕色至黑色，背底为黄色至棕色(图31)。用氯化金调色者，纤维灰色至黑色，背底带粉红的灰色至红紫色。3．Bielschowsky改良法【固定】甲醛液。【试剂配制】氨银溶液：20%硝酸银水溶液30m1，无水乙醇20m1。将此两液混合立即呈现乳白色沉定，逐滴加入浓氨水，使之形成的沉淀刚刚溶解，再滴加5滴浓氨水，过滤后使用。【染色方法】(1)石蜡切片厚8~15μm，脱蜡至水洗。(2)蒸馏水洗1~2min。(3)于37℃温箱内用2%硝酸银水溶液避光浸染25~35min。(4)蒸馏水洗2~3min。(5)用l0%甲醛溶液还原数秒钟，至切片呈现黄色为止。(6)蒸馏水洗3~5min。(7)用氨银溶液滴染20~40s。(8)倾去染液，直接用10%甲醛溶液再次还原1~2min，使之切片呈棕黄色。(9)蒸馏水洗3~5min。(10)用0.2%氯化金水溶液调色3~5min。(11)蒸馏水洗l~2min。(12)用5%硫代硫酸钠水溶液固定3~5min。(13)水洗3~5min，然后用滤纸将切片周围水分吸干。(14)乙醇脱水，二甲苯透明，中性树胶封固。【结果】神经元、轴突及神经纤维呈黑色(图32)。4．Bielschowsky-Roger-Foot改良法【固定】取小块新奇组织用甲醛液固定。【试剂配制】(1)氢氧化铵乙醇液氢氧化铵2m1，95%乙醇100ml。(2)铵银溶液取20%硝酸银水溶液20ml，滴加氢氧化铵数滴，不断摇荡，直至形成沉淀刚好溶解，再滴入10滴氢氧化铵，最后加蒸馏水至40m1，过滤使用。(3)草酸甲醛水溶液草酸2g，甲醛(38%~40%)1ml，蒸馏水100ml。【染色方法】(1)石蜡切片厚5μm，脱蜡至水。(2)用氢氧化铵乙醇溶液处理12~24h。(3)80%乙醇液速洗1次。(4)于30℃温箱内直接用40%硝酸银水溶液暗处浸染20min。(5)蒸馏水速洗l~2次。(6)用20%甲醛水溶液还原3~5min，然后在移入50%甲醛水溶液再次还原3~5min。(7)用滤纸将切片周围的水分吸干。(8)直接用铵银溶液滴染1~3min。(9)蒸馏水速洗或不经水洗直接用滤纸轻轻吸去铵银溶液。(10)用20%甲醛水溶液再次还原3~5min，至切片呈棕黄色为止。(11)蒸馏水洗2~3min。(12)用0.2%氯化金水溶液稍加调色，至切片呈灰黑色为止。(13)蒸馏水稍洗。(14)用草酸甲醛水溶液强化处理5min。(15)水洗3~5min。(16)用5%硫代硫酸钠水溶液固定3~5min。(17)水洗2~3min。(18)95%乙醇及无水乙醇脱水，二甲苯透明，中性树胶封固。【结果】神经元及神经纤维呈灰黑色。第二节神经髓鞘一、神经髓鞘的分类和组成成分神经纤维分为有髓鞘纤维和无髓鞘纤维两大类。有髓鞘纤维经HE染色在光镜下，可见其分三部分：轴突、髓鞘和神经膜；无髓鞘纤维是一些较细的感受纤维和植物神经的节后纤维。髓鞘是一层专门厚的管状结构，为节段性，含60%的脂质和40%蛋白质。脂质包括脂肪、卵磷脂、脑磷脂及胆固醇等。每一节髓鞘有一个雪旺细胞。脑和脊髓的神经大多数属于有髓鞘纤维。二、神经髓鞘染色的应用髓鞘染色在病理诊断和研究中有着一定的意义。髓鞘变性可分为早期、中期和晚期三个时期。在早期着色较深；中期形成脂滴，可用脂质染色加以显示；后期完全溃变并被吞噬细胞清除，故不再有髓鞘的阳性结果。在病理检查中往往发觉溃变神经纤维的原纤维发生肿胀、碎裂，继而成为颗粒状。外周的吞噬细胞部分来自雪旺细胞，中枢神经系统则要紧来自小胶质细胞。神经纤维在许多疾病中都出现髓鞘变性、脱失和轴突变性，如多发性硬化、亚急性脊髓联合变性、急性出血性白质脑炎、种痘后脑脊髓炎、播散性脑脊髓炎、脑桥中部髓鞘溶解、癌症和淋巴瘤时的脑病、多发性神经炎等。上述均需通过髓鞘染色显示病变累及的区域、范围以及程度。三、神经髓鞘染色原理和方法的选择髓鞘染色通常为显示正常和变性髓鞘，可依照病理检查和动物实验性研究的实际要求而选用染色方法。髓鞘是一种脂蛋白，在石蜡切片过程中会丢失一些，但还有足够的磷脂能够保存下来。髓鞘的染色也即脂蛋白的染色，原理有二：①髓鞘的脂质十媒染剂一结合物+氧化后苏木素一“色沉”(蓝黑色)；②锇酸被髓鞘还原并与髓鞘相结合，而使髓鞘呈黑色。髓鞘染色一般分为二大类：①正常髓鞘染色。常用的方法有Loyez法，Weil法，Weigert-Pal法，Kultschitzky法，Luxol坚牢蓝(固蓝)等等。②显示变性髓鞘，即正常不着色，变性髓鞘才着色，常用方法有March法，Swank与Devenport法等。四、具体染色法1．Loyez苏木素染色法【固定】10%甲醛液，石蜡切片厚5~8μm。【试剂配制】碳酸锂苏木素染液苏木素1g，纯乙醇10m1，蒸馏水9m1，碳酸锂饱和水溶液(约1.3%)2ml。先将苏木素溶于乙醇，放入60℃温箱中30min，充分溶解后，加入蒸馏水，最后加碳酸锂。此液临用时配制。【染色方法】(1)组织切片脱蜡至水(必要时在无水乙醇后加火棉胶覆盖液进行处理)。(2)放入4%铁明矾水溶液24h。(3)多次蒸馏水洗。(4)在新配的碳酸锂苏木素液中染12~24h(加温后可缩短时刻)。(5)自来水洗数分钟。(6)0.5%盐酸乙醇分化5~15s。(7)充分流淌水洗，并使之返蓝黑色为止。(8)乙醇脱水，二甲苯透明，中性树胶封固。【结果】髓鞘呈蓝色，底色带淡蓝色。2．Loyez显示三种切片染色法依照作者的经验，此法是数年来标准的石蜡切片染色法，也适用于冰冻切片及火棉胶切片。【试剂配制】(1)LaManna液重铬酸钾9.5g，氯化锌4.5g，蒸馏水加至100ml。(2)碳酸锂苏木素液10%苏木素乙醇溶液(成熟)10ml，碳酸锂饱和水溶液2ml，蒸馏水90m1。(3)Loyez分化液硼砂2g，铁氰化钾2.5g，蒸馏水200m1。【染色方法】(1)组织先固定于甲醛液内，然后再固定于LaManna液24h，置56℃温箱内，使髓鞘的类脂质不溶于脂溶剂，再经脱水及石蜡包埋，效果较好。(2)石蜡切片厚5~8μm，冰冻及火棉胶切片厚15~20μm。(3)石蜡切片后，冰冻切片载于玻片上，现在用火棉胶液封盖，幸免切片脱落，然后常规至水。(4)浸入4%铁明矾水溶液12~24h。(5)蒸馏水浸洗数分钟。(6)入碳酸锂苏木素染液2~4h，置56℃温箱内。(7)自来水洗。(8)用4%铁明矾初步分化，现在髓鞘呈黑蓝色，背景淡灰色，镜下操纵。(9)自来水浸洗10min。(10)用Loyez分化液2min。使之髓鞘呈深蓝色，背景呈乳白色。(11)自来水充分浸洗。(12)乙醇脱水，二甲苯透明，中性树胶封固。3．Weil铁矾苏木素染色法Berube，Powers与Clark(1965年)源于Weil(1928年)。【显示目的】髓鞘。【固定】10%甲醛液。【包埋】火棉胶、石蜡或冰冻切片。冰冻切片应裱在涂有蛋白或白胶的载玻片上，并在空气中干燥。最好是在45℃温箱中烘干。【试剂配制】(1)A液苏木素1g，无水乙醇100m1。此液能够立即使用或放置封存。(2)B液硫酸铁铵[FeNH4(SO4)2·12H2O]4g，蒸馏水100ml。(3)C液铁氰化钾[K3Fe(CN)6)12.5g，硼砂(Na2B4O7·lOH2O)2.5g，蒸馏水1000ml。(4)D液综合染色液，A液l份，B液1份，蒸馏水2份。【染色方法】(1)各种方法的切片按常规进行处理。(2)将切片浸入D液染20min。(3)在水中洗。(4)在B液中分色，直至灰质和白质能够区不为止。(5)在自来水中清洗，蒸馏水中洗2次。(6)在C液中完成分色。(7)在水中洗，蒸馏水洗。(8)用Darrow红染色5~lOmin(Darrow红25mg，0.2M/LWalpole缓冲液pH3.5，蒸馏水200m1，加热溶解过滤)。(9)脱水、透明、封片。【结果】髓鞘深蓝色至黑色，灰质黄色至无色(图35)。(5)乙醇脱水，二甲苯透明，中性树胶封固。【结果】变性髓鞘呈黑色，中性脂肪呈黑色，背景呈淡黄色。第四节溃变神经纤维中枢神经系统受损后发生一系列变化，引人注意的是神经纤维的溃变。19世纪末至本世纪初，多侧重于对神经纤维髓鞘脂肪变化的研究，因而采纳脂肪染色来显示这种变化。许多方法不能显示纤维溃变的全貌，对无髓纤维及轴突终末的变性也无能为力。直到本世纪50年代前后，Glees提出新的方法，即改进的Bielschowsky法，才进一步显示包括无髓纤维在内的各种纤维及其终末的形态改变，然而Glees法在切片上区分溃变纤维和正常纤维尚有困难，追踪溃变纤维仍不容易。不久，Nauta(1950年)也报告了他的Bielschowsky改良法，仍难于区分两种纤维。后来的改进，如磷钼酸、高锰酸钾、改变的氨银以及硝酸铀的处理等，差不多上旨在增加溃变纤维的特异性，如此对后来的技术有促进作用。如“抑制性”的Nauta-Gygax法，Chambers-刘占鳌等的Laidlaw氨银法，又Nauta自己的改进以及60年代和70年代的Fink-Heimer法，Ebbesson-Robinson法等，对区分溃变和正常纤维“鉴定轴’突的终末各有其特点。1．Nauta染色法(1957年)【操作技术与染色方法】(1)组织固定于10%甲醛液，必要时可适当加和气震动以缩短固定时刻(更换固定液3次)。(2)冰冻切片厚30~50μm，切片置入10%甲醛液内，依照需要可将切片切成不同的厚度(25~50μm)，然后加以选择，如一时来不及处理，冰箱内可较长时刻贮存而不变质。(3)镀银时每次以数片为宜(如5~20片)，略水洗后按以下步骤处理。①浸入0.5%磷钼酸水溶液15~30min。②切片速洗后转入0.025%~0.05%高锰酸钾水溶液，分不以切片试处理5、10及15min，这一步是抑制未溃变纤维的关键；时刻过短抑制不足，时刻过长则可使溃变纤维不易银染而受到抑制。如用0.025%浓度的高锰酸钾，则时刻变动的幅度较大，比较容易掌握。此外，切片的厚薄亦与作用的时刻有关。一般情况下，长时刻固定的组织，处理时刻需短些。③在等量的1%草酸和对苯二酚液内消色，至少2min。尽管可能不到1min即消色，但给以加倍的时刻会使消色作用完全。(4)经蒸馏水充分洗涤。(5)经1.5%硝酸银15~30min，再经水洗两次。以后均应逐片处理。(6)切片在Laidlaw银液内应不停地摇荡45~60s。Laidlaw氨化碳酸银液配制法：①用250m1量杯内溶12g硝酸银于20m1，双蒸水中。②加230ml饱和碳酸锂(9℃时为1.33%CP)溶液，立即产生沉淀，猛摇。⑧待沉淀下沉至70m1刻度时小心倾去上清液，再加蒸馏水至250ml刻度处，再摇动。静止后又待沉淀下沉至70ml刻度处，再次倾去上清液。如此反复沉淀3次。④再待沉淀下沉至70m1刻度时，小心倒去上清液。然后边摇边慢慢滴加浓氨液至溶液几乎透明为止(约需9.5m1浓氨水，实际上常略多于9.5m1)。慎勿加多。配好后略有氨气味。⑤用蒸馏水稀释至120ml。过滤于洗净(化学洁净)的瓶内。置白炽光下至少两周，遂见瓶壁呈现一层银镜反应，但无碍其作用。用前过滤。（7）切片直接递入还原液（10%甲醛13.5m1，1%枸椽酸液13.5m1，95%乙醇45m1，蒸馏水400m1），约1min，切片还原为棕色，至2min为止。现在不断轻摇，勿使切片沉底不动。假如还原时刻过久而色太暗，可在每20m1银液内加氨液4滴；如色太淡则加数滴2.5%氢氧化钠于银液中。（8）切片速经水洗，浸于1%硫代硫酸钠1min，再用蒸馏水洗数次。（9）用Albrecht明胶-乙醇法封片。Albrecht明胶-乙醇封片法：入等量1.5%明胶及80%乙醇约5min，将切片捞于载玻片上，使用新滤纸略吸干。入95%乙醇最后凝固明胶。（10）脱水、透明、封片。【结果】粗细不一的溃变纤维均染成黑色，背景黄褐色。但有一些正常轴索被镀银成黑色。溃变纤维所终止的细胞可见有溃变的细胞周围或树突周围纤维。胞体及树突近侧端染成淡褐色。色素类第一节黑色素一、黑色素的差不多概念、形成机制和分布黑色素从字义上是一种黑色的色素，但实际上这种色素在显微镜下通常不呈黑色，而呈黄棕色或棕褐也，其颗粒大小不一。黑色素在黑色素母细胞内合成，黑色素母细胞起源干神经脊，在胚胎发育过程中，由神经脊移行到皮肤、眼和中枢神经系统。因此，在正常情况下，皮肤的表皮、毛囊、眼的虹膜、睫状体、脉络膜，脑的软脑膜、黑质、蓝斑、迷走背核，以及交感神经节和脊神经节的节细胞内均可有黑色素沉着。在病理情况下可能在全身各处含有黑色素沉着物。黑色素母细胞的粗面内质网和高尔基体是形成黑色素的场所，他们以酪氨酸为原料，在酪氨酸酶的氧化作用下，通过一系列变化形成黑色素。二、黑色素的病理诊断分类和染色的应用。1、用于黑色素的诊断在疑为黑色素瘤，尤其是未分化的肿瘤组织中，或在淋巴结内的肿瘤细胞中，证实有黑色素时，往往要考虑为黑色素肿瘤。另外当黑色素专门少时，黑色素染色可使黑色素容易发觉。当病变时黑色素含量多时，可用漂白法以便视察核的结构和核分裂现象以利诊断。2、其它色素性神经瘤、透明细胞肉瘤也有黑色素存在，皮病性淋巴结炎时，淋巴结内也可有黑色素沉着。3、皮肤病有黑色棘皮病、老年疣、白癜风、色素性荨麻疹、瑞尔黑变病、网状色素性皮肤异色病、红斑狼疮、扁平苔藓和许多内分泌代谢性疾病（阿狄森病、肝病等），这些疾病的皮肤中都有色素沉着或脱失。然而在染色应用上，只是用必要的情况下用黑色素染色法。4、神经黑色素中枢神经系统的黑质、蓝斑以及其它部位神经细胞的色素和皮肤的黑色素稍有区不，又称神经黑色素。Graham(1979年)指出它们不是通过酪氨酸酶的作用形成，而是儿苯酚胺代谢的产物，这些神经细胞没有通过黑白素母细胞的黑色素小体。色素的量也随年龄而增加，但色素本身并可不能引起神经元的变性。提示这种色素通过黑色素染色法，可供神经研究的参考。5、假性黑变病色素这种假性黑变病色素要紧见于大肠，阑尾和小肠次之，故又称为结肠黑变病。在临床上见严峻便秘和适应用鼠李皮作缓泻剂者。在固有膜巨噬细胞内有一种性质不明的色素，普鲁士蓝反应弱阳性，PAS阳性。有人认为是含铁血黄素与肠道内细菌所产生的硫化氢相作用而形成的硫化铁；也有人认为是肠道内汲取的蛋白质分解而生成的黑色素、脂褐素相似的物质。通过黑色染色能够得到证明。但还需用不的色素法作为对比用。三、黑色素在固定和染色方面的问题黑色素是不含铁而含硫的色素，这种色素是十分稳定的物质，完全不溶于水及有机溶剂，然而长时刻在强碱中则可被溶解。因此黑色素组织特不容易保存，采纳一般的固定和石蜡包埋均可不能丢失。依照黑色素的性质通过强氧化剂可使之脱色，再用氨银液可将其还原为金属银的能力，使之呈现黑色。应指出的是，有一些黑色素用PAS反应可呈阳性结果，曾有作者在一例透明细胞肉瘤中见到PAS阳性的黑色素反应。依照Lillie(l957年)发觉黑色素能和亚铁离子结合(鳌合)，使黑色素先在FeSO4中形成亚铁的黑色素化合物，再用滕波尔反应，就能够利用那个非敏感的反应移植到显示黑色素(呈深绿色)的技术方法中。除了用染色的复合试剂显示以外，还可用单一的漂白法来证明黑色素是存在依旧被去除。常用的有过氧化氢、高锰酸钾、过乙酸、过甲酸、三氯化铁等，可将黑色素的酚环打开而使黑色素脱色。1、MassonFontana银浸法(1929年)[固定]10%中性甲醛液或乙醇液，不能用含有铬酸盐的固定液固定。[试剂配制]Fontana银液：用l0%硝酸银水溶液20ml，逐滴加入浓氨水，至沉淀消逝呈微乳白质，加蒸馏水20ml。此液贮存在棕色蘑口瓶内，置暗处过24h后可才应用，假如此溶液贮存在冷暗处，可保存1个月，但最好于2周内使用。[染色方法](l)切片脱蜡至水。(2)用蒸馏水充分洗涤。(3)投入Fontana银液，置于室温下暗处18~48h。(4)经蒸馏水洗数次。(5)用0.2%氯化金水溶液处理5min。(6)蒸馏水洗3min(7)用5%硫代硫酸钠水溶液固定2min。(8)流水冲洗2min。(9)用1%藏红花红或VanGieson染色1min。(10)自来水洗1min。(11)95%、无水乙醇脱水，二甲苯透明，中性树胶封固。[结果]黑色素及嗜银细胞颗粒虽黑色；角蛋白呈橙色；其它呈复染色。2、Lillie亚铁反应法[固定]10%甲醛及Carnoy液，不用含铬盐的固定液。[试剂配制](1)硫酸亚铁溶液硫酸亚铁(FeSO4·7H2O)2.5g，蒸馏水100ml。(2)醋酸铁氰化钾溶液1%醋酸水溶液100ml，铁氰化钾1g。[染色方法](l)切片脱蜡至水。(2)硫酸亚铁溶液中浸60min。（3）用蒸馏水洗20min（需更换3次）。(4)在醋酸铁氰化钾溶液中染30min。(5)用1%醋酸液分化。(6)入VanGieson液中复染30s。(7)95%、无水乙醇脱水，二甲苯透明，中性树胶封固或DPX封固。[结果]黑色素呈暗绿色；背景浅绿或不着色。用V·G复染时，胶原纤维呈红色，肌肉和胞浆黄色和褐色。含铁血黄素用此染色法也能呈阳性，可结合铁反应法来鉴不。3、Dopa黑色素反应法本法为通过Laidliw修正之Bloch法（1932年）。我们要求采取新奇组织或组织固定于5%甲醛液(至多固定2~3h)。用冰冻切片。为预防反应作用受阻碍，冰冻切片浸水时刻不超过数秒钟。[试刑配制](1)Dopa贮藏液：溶解0.2%3，4一二羟苯丙氨酸（Dopa）于100或200ml蒸馏水。紧闭瓶口，放入冰箱，可保存数周。此液呈深红色时即失效。(2)缓冲液溶解磷酸氢二钠(Na2HPO4·2H20)]11g于1000ml蒸馏水中(甲液)，溶解磷酸二氢钾(KH2PO4)9g于1000ml蒸馏水中（乙液）。甲、乙两液分不贮藏于冰箱。临用时，取甲液6ml及乙液2ml与25mlDopa贮藏液混合，即成染液。在一定之温度中，反应速度以pH值为转移。当pH值为7.4，温度37.5℃时，则反应在4~5h内完成，若于配制染液时改用乙液lml，则pH值为7.70；若完全不用乙液，则pH值在8.2，在此碱性溶液中，温度不变则反应在1h内完成。但此加速法促成组织浓染，用缓馒反应可靠。基于上述缘故，使用微量碱性之玻璃皿器亦有浓染趋势；使用微量酸性者则不发生反应，因此，所用一切皿器必须没有酸碱性反应，绝对保持皿器清洁。[染色方法](1)浸切片于Dopa缓冲染色液约30min，温度37.5℃。(2)更换l次染液(预先贮藏冰箱中者)。(3)每30min镜检1次，2~3h后染液变红色，3~4h后染液变棕色，亦即切片染色适宜之表现。(4)水洗。(5)95%乙醇、无水乙醇脱水，二甲苯透明，封固（人工胶最好）欲染配色，先洗于水。Laidlaw主张用0.5%焦油紫水溶液染色，以95%乙醇分化，或用结晶紫乙醇液染配色也可(Cowdry)。[结果]Dopa阳性反应细胞浆（黑素母细