RNA原位核酸杂交方法

RNA原位核酸杂交方法一、基本原理RNA原位核酸杂交(RNAnucleicacidhybridizationinsitu)又称RNA原位杂交组织化学(RNAinsituhybridizationhistochemistry)或RNA原位杂交[6,7,25](RNAinsituhybridizationRISH)。该技术是指运用cRNA或寡核苷酸等探针检测细胞和组织内RNA表达的一种原位杂交技术。其基本原理是：在细胞或组织结构保持不变的条件下，用标记的已知的RNA核苷酸片段，按核酸杂交中碱基配对原则，与待测细胞或组织中相应的基因片段相结合(杂交)，所形成的杂交体(Hybrids)经显色反应后在光学显微镜或电子显微镜下观察其细胞内相应的mRNA、rRNA和tRNA分子。RNA原位杂交技术经不断改进，其应用的领域已远超出DNA原位杂交技术。尤其在基因分析和诊断方面能作定性、定位和定量分析，已成为最有效的分子病理学技术，同时在分析低丰度和罕见的mRNA表达方面已展示了分子生物学的一重要方向。RNA原位杂交不同于DNA原位杂交主要有：(1)使用的探针不同：RNA原位杂交中多采用RNA或寡核苷酸探针，因此避免了应用双链DNA探针在杂交反应中存在的两条链之间的复性和第二条链的竞争性杂交问题。cRNA-RNA之间形成的杂交体要比DNA-DNA、cDNA-RNA杂交体性能稳定，在杂交反应后可用RNA酶洗脱，以除去未结合的探针，因此特异性更强。(2)检测的目的不同：RNA原位杂交检测和分析的主要为内源性基因，包括细胞内固有基因、异常基因和变异基因。以正确反映组织与细胞之间相互关系及功能和代谢状态、探索疾病发病机理、观察治疗的疗效和评估疾病的预后等。其次为对外源性基因检测，以获得病毒和细菌类型等病原学诊断。而DNA原位杂交主要为外源性基因检测。(3)有较高的灵敏度：在检出细胞和组织内在低拷贝核苷酸时，RNA原位杂交能获得较好定位，而DNA原位杂交则难以信任。但RNA原位杂交也存在某些不足之处，为使RNA原位杂交标准化和克服其不足之处必须注意以下几点：(1)不同探针种类的选择、制备和标记要适合靶核酸和组织的特点；(2)有效制止组织和细胞内RNA降解；(3)实验流程中严防RNA酶污染；(4)对杂交信号有效的放大和显色技巧；(5)阳性结果判别，不仅需要有阳性和阴性标本对照，有条件的更需要观测Northern杂交和免疫组化对同一组织的冰冻切片和石蜡切片中，基因及其产物两者表达之间联系。(6)在实验流程的各个技术环节中熟练运用技术控制是保证RNA原位杂交成功的必要条件。近几年来RNA原位杂交已得到稳步发展。主要表现在：非同位素标记的探针制备和标记技术的进步、杂交信号放大的应用、组织预处理的改进、RNA原位杂交和免疫组化双重检测技术和激光共聚焦显微镜在多重RNA原位杂交中应用等。从理论上讲，RNA原位杂交已趋成熟和完善，关键是在实际应用中能否被人们所受接并应用到各学科的研究中，促进人们对各类基因识别和表达规律的认识。二、RNA原位杂交中的探针探针的种类RNA探针是指带有标记的能与组织内相对应的核苷酸序列互补结合的一段单链cDNA或cRNA分子。根据在RNA杂交中所使用的探针依其来源可分为三种：即特异性cDNA.cRNA探针和人工合成寡核苷酸探针。单链cDNA探针：由于cDNA中不存在内含子及其它高度重复序列，又克服了双链cDNA探针在杂交反应中两条链之间复性的缺点，从而提高了杂交反应的敏感性。但由于单链cDNA探针的制备比较困难，在RNA原位杂交中已很少见有应用。cRNA探针：是以cDNA为模板，通过体外转录而获得的。因为它是一种单链探针，因此也避免了应用双链cDNA探针做杂交反应时存在的两条之间的复性问题。cRNA与RNA之间形成的杂交体要比cDNA-RNA杂交体稳定。cRNA-RNA之间形成的杂交体不受RNA酶的影响。因此杂交反应后可用RNA酶处理，以除去未结合的探针。由于cRNA探针具有以上这些优点，cRNA探针的杂交饱和水平又比双链DNA探针高出8倍，因此在原位杂交中应用广泛。cRNA探针的缺点是：探针的制备过程比较复杂，需要较好的分子生物学实验设备，它对RNA酶敏感，易受破坏，操作中要谨防RNA酶污染。寡核苷酸探针：人工合成的寡核苷探针是以核苷酸为原料，通过DNA合成仪合成，避免了真核细胞中存在的高度重复序列带来的不利影响。由于大多数寡核苷酸序列较短，不需要纯化，组织穿透性极好。根椐目的基因的特异性序列设计的探针，特异性较强。合成的寡核苷酸探针的缺点是：探针长度必须适宜，探针太长可造成内部错误配对杂交，探针太短可形成非特异性结合。它与mRNA形成的杂交体不如cRNA-RNA杂交体稳定，再则探针较短，所携带的标记物少，敏感性较低。依标记物不同，探针又可分为同位素标记探针和非同位素标记探针两大类。前者主要包括3H、 35C、32P和1251等，不同的同位素探针其穿透力，定位和半衰期各不相同，无一种同位素探针具有穿透力强、定位好和半衰期长所有优点。由于半衰斯短，性能不稳定，污染环境和危害健康等原因，在RNA原位杂交中应用同位素标记探针已日趋减少，而非同位素标记探针在近年来得到迅速发展，其标记物主要有生物素、地高辛、酶和荧光标记等。其中地高辛标记的cDNA、RNA和寡核苷酸探针，不但探针的具有生物素标记优点，还克服了生物素标记的探针在原位杂交过程中受组织内源性生物素干忧等缺点，其应用越来越广泛。（二）探针的标记在RNA原位杂交中，不仅要选择适当的探针，而且还要使探针得到有效的标记。探针标记法有酶反应法和化学反应法。酶反应法：用于RNA探针的酶反应法主要为末端标记法与体外转录法。末端标记法是将标记物导入线型DNA或RNA的5'端或3'端的一种标记法，末端标记适用于合成寡核苷酸探针的标记，用末端标记制备的探针一般携带的标记分子较少。体外转录法：体外转录法是一种制备与克隆片段序列相同的单链RNA探针的方法。进行体外转录时，先将靶核苷酸序列克隆到含噬菌体转录启动子的载体中，然后在RNA聚合酶的作用下，以DNA为模板，以含有标记的三磷酸苷为原料，对启动子下游的序列进行转录，而启动子本身并不被转录。体外转录常用噬菌体转录启动子，如沙门氏菌噬菌体和大肠杆菌噬菌体T3、T7。当两个不同的噬菌体转录启动子结合在载体多克隆位点的两侧，用适当的限制性内切酶在插入序列的下游将质粒线性化。SP6噬菌体的RNA聚合酶对SP6启动子序列具有高度的亲和性，从而启动下游的转录，在4种三磷酸核糖核苷和相应的噬菌体RNA聚合酶存在的条件下，即转录成RNA。如反应物中含有标记的三磷酸核糖核苷，所有的RNA就被标记。依标记物为同位素和非同位素，近年来非同位素标记探针已有了极大的近步。常用非同位素标记技术有生物素、地高辛、碱性磷酸酶、辣根过氧化酶和荧光素。非同位素标记法又可分为直接标记法和间接标记法。直接标记法是将标记物直接结合到探针上，当探针与组织内相应靶核苷酸结合后，即可显色观察。这类标记探针必须符合标记物在杂交过程中不丢失，又不影响杂交反应为条件。大量已发表的文献表明，由于检出杂交信号受到多种因素制抑，只能限于靶RNA丰富的细胞或组织中，RNA杂交对低拷贝的基因检测不理想。近年来间接标记法得到较快发展，先将标记物结合在探针上，通过特异性抗体识别，由特异性抗体结合多种酶，对检测的杂交信号作有放大，这一类标记法已展示极好的发展前景。（三） 探针的纯化某些标记探针必须经纯化后方可使用。这是因为在探针标记过程中，反应液中仍存在一些未被结合到探针中去的剩余dNTP等小分子。为将掺入并结合到cDNA、cRNA和标记寡核苷酸与游离的标记寡核苷酸分开，常使用乙醇沉淀法或酚/氯仿抽提法进行纯化。乙醇沉淀法的原理是：DNA可被乙醇沉淀，而未掺入DNA的dNTP则保留在上清液中，由此反复乙醇沉淀能将两者分开。核酸溶液中去除蛋白质的酚/氯仿抽提法的原理是：交替使用酚、氯仿这两种不同的蛋白质变性剂，以增加去除蛋白质杂质的效果。因为酚虽能有效地变性蛋白质，但它不能完全抑制RNA酶的活性，而且酚能溶解10-15%的水，从而溶解一部分ploy（A）RNA。为克服这两方面的局限，混合使用酚与氯仿，对于RNA提取，显得更加重要，氯仿还能加速有机相与液相分层，去除植物色素和蔗糖。（四） 杂交前准备载玻片和盖玻片的处理为有效防止外源性RNA酶的污染，杂交用的载玻片和盖玻片可按以下步骤处理。将载玻片和盖玻片分别浸泡在5%洁消精（苏洲吴县化工二厂）中12小时，用35°C-40°C温水中冲洗30min,再用双蒸水漂洗3次，每次5min,室温下干燥切片后，在180C烤箱内烘烤4－6小时，盖玻片可按近期内所需量，用铝箔纸包裹后烘烤后存放。为防止组织或细胞标本在杂交过程中漂起或脱落，载玻片应涂以粘附剂，大的冰冻或石蜡切片建议用明胶粘附剂，活检或较小的标本建议用多聚左旋赖氨酸或硅烷粘附剂。明胶涂片制备取10克明胶（Merck）溶于1000毫升40C—50C双蒸水中，待明胶完全溶解后加入4毫升25%硫酸铬钾溶液（chromiumpotassiumsulfateCPS），使CPS的终浓度为0.1%。将烘烤后的载玻片浸泡在明胶溶液中10min,在室温下干燥玻片。再将载玻片浸泡在含有1%多聚甲醛，PH7.4的PBS溶液中10min；在室温下干燥玻片后再将载玻片浸泡在含有1%多聚甲醛，PH7.4的PBS中10min,在室温下干燥玻片。60C烤箱内过夜备用。多聚左旋赖氨酸涂片的制备取2-4mg多聚左旋赖氨酸（Sigma）,分子量在300000以上，溶于1ml消毒去离子水中。经旋涡器反复搅拌，吸取20-30pl滴加到玻片一侧，再取另一张载玻片复合，将赖氨酸溶液均匀涂抹在裱组织切片处，并将涂有粘附剂的一面用钻笔标出，室温下干燥切片后，在60°C烤箱内过夜备用。硅烷涂片的制备取5毫升氨基丙基三乙氧基硅烷(3-aminopropyltriethoxysilaneAPES)(Sigma)溶于250ml丙酮内。将烘烤后的载玻片浸泡硅烷溶液中60min,用双蒸水漂洗2次，每次10min干燥玻片后，60C烤箱内过夜备用。注意事项：载玻片的粘附剂及涂片制备，以组织切片或细胞不脱落，不干扰杂交信号，低背景，经济及制备方便为原则，在制备过程中，需戴一次性手套及口罩，防止手指皮肤上孤NA酶的污染。多聚左旋赖氨酸溶液的溶度可按实际应用效果调整，并应注意有效期限，制备载玻片应尽快使用，防止赖氨酸解聚而失效。新鲜标本的储存和冰冻切片制备为RNA原位杂交作新鲜标本储存和冰冻切片过程中，应严防RNA酶的污染，制备过程中所使用的容器、刀具等均经高压消毒或清洁后用0.1%焦碳酸二乙酯(DiethylpyrocarbonateDEPC)水清洗。为防止RNA迅速降解，标本离体后，先切成1.5x1.2cm大小，其厚度不超过0.2cm，应迅速投入4%多聚甲醛溶液内，置4C冰箱内2-4小时。再将组织移入30%蔗糖PBS溶液内，4C冰箱内过夜。次日可将标本储存于-80C或-140C超低温冰箱内保存。如作冰冻切片，先将组织在-20C恒冷切片机内停留，待温度回升后，然后在恒冷冰冻切片机内切成7pm薄片。40C烤箱内干燥切片2小时后储存在-80C或-140C超低温冰箱内备用。标本的固定和石蜡切片的制备石蜡切片作RNA原位杂交的，也应严防RNA酶的污染、容器、刀具等去除RNA酶的过程同冰冻切片。为防止RNA迅速降解，离体后标本应立即有效固定。为保存良好组织结构，有利探针的穿透力，应选用合适的固定剂。常用的化学固定剂可分为，沉淀固定剂和交联固定剂两类。前者有乙醇，甲醇和丙酮等，后者有多聚甲醛，甲醛和戊二醛等。经沉淀固定剂固定的组织通透性较好，利于探针穿入，但过长时间固定，可引起RNA降解。其不足之处是：组织形态结构的保持不如交联固定剂。交联固定剂能较好保存组织中RNA和组织形态结构，但固定时间过长，也可发生胞浆和胞核内大分子化合物形成交联，影响探针的穿透力，阻碍杂交体的形成。4%多聚甲醛固定液取4g多聚甲醛和0.25g甘氨酸分别溶于100ml0.01mol/LPH7.0PBS溶液，组织在常温下浸泡于4%多聚甲醛中4小时，每1小时将组织在真空下吸干10min,再注入新的固定液，共4次。然后用0.01mol/LPH7.0的PBS漂洗2次，每次30min。福尔马林醋酸固定液福尔马林醋酸固定液由50%酒精、10%福尔马林和5%醋酸组成。在常温下将组织浸泡4小时，每1小时在真空下吸干10分钟，再注入新的固定液，共4次，然后用50%酒精漂洗2次，每次30min。杂交前探针的选择RNA探针：RNA探针的长度以50-150碱基为佳，探针易进入细胞，杂交率高，杂交时间短。长500个碱基的探针杂交时间约需20个小时左右，如超过500个碱基的RNA探针则在杂交前用有限碱基水解法控制其长度。孵育时间t=Lf-Lo/KxLoxLf(Lo=核酸探针原长度(kb),Lf=核酸探针水解后所需长度(kb),K是常数率=0.11kb/min)。在室温中加入下列试剂终止水解：3mol/L醋酸钠，6.6川(终浓度0.1mol/L),醋酸1.3川(终浓度为0.5%)。加入下列试剂沉淀探针：7mol/L醋酸铵100川，100%乙醇750|jl,RNA(10mg/ml)2川，置-20°C2小时后恢复到室温，在1400rpm离心30min。小心将乙醇倒出，待试管内干燥后再用无菌ddH2O稀释到10ng/pl浓度。最终探针长度可于10%聚丙稀酰胺凝胶在60C的尿素中电泳检测。探针的长度原位杂交反应中探针浓度应超过靶序列的浓度，探针浓度必须给予该实验最大信噪比，因为背景着色度高低与探针浓度有关。最佳探针浓度是最低探针浓度达到靶核酸的最大饱和结合度为目的。探针浓度按其种类而略有不同，放射性标记cRNA探针的浓度为0.5ng/pl，而非放射性标记cRNA探针的浓度1.0ng/pl。杂交液的量要适当，每张切片以30-50pl为宜。保持杂交液不流失的关键是，载玻片的清洁处理必须彻底，应用杂交罩等也很必要。杂交的温度和时间设置和调整杂交温度是RNA原位杂交的重要环节。杂交温度应低于解链或融解温度(meltingtemperatureTm)20-30C。多数RNA原位杂交Tm为95C，由于这一温度对保存组织形态完整和组织切片的粘附将产生不利影响，为此在杂交液中常以增加甲酰胺浓度来降低Tm值，因为每增加1%甲酰胺浓度可降低0.72C。另外杂交体中GC的百分比，杂交体长度以及杂交液中Na+的浓度也与Tm呈正相关。杂交反应的时间可随探针浓度的增加而缩短，杂交时间过短会造成杂交不完全，杂交时间过长会增加非特异性着色。一般RNA原位杂交采用杂交孵育过夜，在黑暗环境下进行，可以避免光线对甲酰胺的电离作用。三、cRNA探针检测组织切片中的RNA原位杂交组织的前处理冰冻切片的制备：(1)离体后组织应切成1.5x1.2cm，厚度为0.2cm。(2)立即投入4%多聚甲醛溶液中(PBS新配制)，4C下固定2-4小时。(3)倒去固定液后，加入30%蔗糖溶液(PBS新配制)，4C下过夜，次日将组织块储存在-80C或-140C超低温冰箱内。(4)或将组织块置于-20C恒冷切片机内切成10pm薄片，粘附于涂有粘附剂的载玻片上置室温下，置40C恒温箱内过夜，或置40C恒温箱内至少2小时，后将切片放入切片盒在-80C超低温冰箱内存放备用。组织的固定和石蜡切片的制备：(1)离体后组织切成不大于1.5x1.2cm、厚0.2cm。(2)立即投入4%多聚甲醛溶液内(PBS新配制),或2.5%戊二醛，在室温下固定3-4小时。(3)用PBS冲洗，经梯度酒精脱水、二甲苯透明和浸蜡包埋切片。(4)切成5pm薄片粘附于涂有粘附剂的载玻片上，在40°C恒温箱内过夜干燥切片，用新的二甲苯脱蜡2x10min和100%、95%、70%、各级酒精1x5min,ddH2O漂洗2x5min。注意事项切除的新鲜标本应立即作组织固定或低温储存，以免mRNA降解。标本尽可能采多聚甲醛固定及蔗糖浸泡作冰冻切片,这一制备法既能避免mRNA降解，又能保持良好的组织形态。对外检病例中，采用10%福尔马林固定标本的，为利于mRNA检测，固定时间不要超过36小时，以免引起RNA与蛋白质之间发生交联。在冰冻切片和石蜡切片制作过程中，所使用的容器、器械都要经高压消毒，或清洁后用0.1%DEPC水清洗，再经ddH2O冲洗，避免外源性RNA酶污染。RNA探针的标记RNA探针的制备需将cDNA探针克隆到带有RNA多聚酶启动子的质粒，然后转录制成RNA探针。用EDTA缓冲液和DEPC处理的ddH2O将会影响RNA多聚酶中的质粒。RNA探针的长度应V500bp,>500bp的探针不易与mRNA形成杂交体。对探针标记、预杂交、杂交和后杂交流程中使用的容器、ddH2O均需经0.1%DEPC处理，为避免RNA酶污染，操作人员必须戴手套和口罩操作。RNA探针的纯化：①在杂交探针中加入5pl10%乙酸(aceticacicl),11pl3mol/L醋酸纳PH6.0，1pl10mg/mltRNA，1.2pl1mol/LMgCl2,300pl冷酒精。②在-20C孵育4-16小时。③在4C下15min,使RNA发生沉淀。④真空下干燥RNA沉淀物。⑤用DEPC处理的ddH2O含标记的RNA探针10—50pg/ml。RNA探针的水解：按以下方法减少探针长度为近200bp，在Microcentrifuge管内加入50plRNA探针标记液，力口入30pl200mmol/LNa2CO3和20pl200mmol/LNaHCo3。将杂交探针置于60C条件下，按以下方法计算水解时间，t=(L0—Lf)/(K.LO.Lf)(L0=RNA探针原长度(kb),Lf=RNA探针水解后所需长度，K=常数率(K=0.11kb/min),t=水解时间)。预杂交(1)切片用DEPC处理的PBSPH7.4(140mmol/LNaCl,2.7mmolKCl,10mmol/LNa2HPO4,1.8mmol/LKH2PO4)孵育2x5min,再用DEPC处理的含100mmol/L苷氨酸(Glycine)PBS孵育切片2x5min°(2)用DEPC处理的含0.3%TritonX-100PBS孵育15min。(3)用DEPC处理的PBS漂洗2x5min。(4)冰冻切片用TE缓冲液(100mmol/LTris-HCl,50mmol/LEDTAPH8.0)不含RNA酶的1pg/ml蛋白酶K,在37C下通透切片30min。石蜡切片用TE缓冲液配制的不含RNA酶的5-20pg/ml蛋白酶K,在37C下通透切片30min。(5)在4C下用DEPC处理的4%多聚甲醛PBS溶液作后固定5min。(6)再用DEPC处理的PBS冲洗切片2x5min。(7)切片作酸酐处理，处理液含0.25醋酸酐、0.1mol/L三乙醇胺(TriethanolamineTEA)PH8.0,振荡漂洗2x5min。(8)在37°C孵育切片后，杂交缓冲液冲洗(含50%去离子甲酰胺的4xSSC)，至少10min。注意事项切片的通透化是RNA原位杂交关键步骤，特别对回顾性资料尤为重要，因固定液种类和固定时间的不同，需作最佳通透化条件探索，包括蛋白酶K浓度，孵育时间20-30min之间调整，甚至采用0.2mol/LHCL配制的0.1%胃蛋白酶。由于醋酸酐极不稳定，宜将醋酸酐在使用前加到TEA缓冲液中。1xSSC=150mmol/LNaCl,15mmol/LsodiumcitratepH7.2。原位杂交(1)杂交液(40%去离子甲酰胺、10%葡聚糖、1xDenhardt's、0.02%Ficoll、0.02%聚乙烯吡咯烷酮(polyvinylpyrrolidone)、10mg/ml去RNA酶的牛血清、4xSSC、10mmol/LDTT、1mg/ml变性的剪切鮭鱼精子DNA)的准备。(2)沥干后用杂交缓冲液漂洗，并沿组织周边擦干，每张切片滴加30pl探针杂交液(内含5-10ng非同位素标记cRNA探针)。(3)用24x30mm杂交罩(hydrophobicplasticcoverslip)复盖杂交组织。置42C湿盒内过夜。注意事项：杂交液应新配制，并在-20C下储存，新配制杂交液能使用几个月。杂交后处理(1)揭去杂交罩将切片浸泡于2xSSC中5-10min。(2)在37C用2xSSC2x15min、1xSSC2x15min振荡漂洗。(3)为消除未杂交单股cRNA探针，在37C含RNA酶A的NTE缓冲液(500mmol/LNaCl,10mmol/LTris,1mmol/LEDTA,PH8.0)中漂洗30min。(4)置37C用0.1xSSC振荡漂洗2x30min。注意事项在同一容器中不能同时放入含不同探针切片。(2)如果杂交的背景较高，非特异性信号较多，可采用52C含5%甲酰胺的2xSSC洗脱。杂交后显色(1)用BufferAPH7.5(100mmol/LTris-Hcl,150mmol/LNaCl)振荡漂洗切片2x10min。(2)每张切片滴加封闭液40pl(含0.1%TritonX-100和2%正常羊血清的BufferAPH7.5)。(3)抖去封闭液，每张切片加羊抗地高辛抗体AKP结合物30pl(BufferA内含0.1%TritonX-100,1%正常羊血清，羊抗地高辛抗体AKP结合物)在温盒内2小时。(4)用BufferA振荡漂洗切片2x10min。(5)用BufferBPH9.5(100mmol/LTris-Hcl,100mmol/LNaCl，50mmol/LMgCl2)孵育切片10min。(6)显色液配制：用10mlBufferBPH9.5，内含45|jl硝基四氮唑蓝(NitrobluetetrazoliumNBT)(75mg/mlNBT,70%二甲基甲酰胺)，35pl5—溴一4—氯一3—吲哚基一磷酸盐(5-bromo-4-chloro-3-indoly卜phosphateBCIP)或X-Phosphate(50mgX-Phosphate/ml,100%二甲基甲酰胺)。(7)每张切片200pl显色液，在黑暗条件下显色2-24小时。(8)显色满意后用BufferCPH8.1(10mmol/LTris-Hcl,1mmol/LEDTA)冲洗漂洗切片。(9)ddH2O中止反应。(10)用0.02%亮绿或0.1%核固红复染细胞核1-2min。(11)用自来水洗2x10min。(12)用即用型(GvaMount)水溶性封片剂封片。注意事项显色液的配制：10mlBufferBPH9.5溶液中含有45plNBT(70%二甲基甲酰胺中含有75mg/1mlNBT)，35plBCIP或X-磷酸盐(100%二甲基甲酰胺中含有50mg/mlX-磷酸盐)，1mmol/L左旋咪唑(levamisole)(2.4mg/10ml左旋咪唑Sigma)。抗地高辛抗体一AKP的最佳浓度探索可采用同一杂交切片，用1:100、1:500和1:1000抗体浓度比较之。如果显色液中用1mmol/L左旋咪唑的浓度，仍然发现内源性磷酸脂的活性较高(背景色)，左旋咪唑的浓度可以增加到5mmol/L。NBT/BCIP显色液后杂交切片，不能用二甲苯透明和溶二甲苯的封片剂。滴加杂交液和显色液应防止流失，除标记切片放平整之外，很重要的原因之一与载玻片的清洁度有关。用DAKO魔笔沿组织周围划圈，在杂交反应中既可省略杂交罩、又可在显色反应中防止反应液外溢。四、用寡核苷酸探针检测组织切片中的RNA原位杂交用寡核苷酸探针检测组织切片中相关的mRNA(靶核苷酸)是较为常见的RNA原位杂交。这是因为寡核苷酸探针不仅具有能按靶核苷酸序列设计与特定的靶基因结合，而且以核苷酸为原料通过DNA合成仪合成。寡核苷酸探针方法简便，探针一般较短组织穿透性好，无须进一步纯化等优点外，而且易于在组织切片内检测靶mRNA的一种理想的原位杂交探针。作者运用生物素及地高辛标记的寡核苷酸探针，对17例新鲜乳腺癌组织分别作了RNA原位杂交和Northern杂交。冰冻切片中RNA原位杂交，ERmRNA阳性率64.6%(11/17),PRmRNA为58.9%(10/17),而Northern杂交中ERmRNA阳性率为76.5%(13/17)、PRmRNA阳性率为64.7%(11/17)。上述两种杂交中ERmRNA阳性、阴性符合率分别为58.7%和17.7%,PRmRNA为47.1%和23.5%。在此基础上作者还对278例乳腺癌分别作了RNA原位杂交和免疫组化对照检测。石蜡切片中RNA原位杂交，ERmRNA、PRmRNA的阳性率分别为67.3%和61.9%，高于同一组织切片中免疫组化的ER52.9%和PR的41.8%,ERmRNA、PRmRNA的阴性率为32.7%和38.1%，又低于同一组织切片中免疫组化的ER47.1%和58.2%。ERmRNA与ER的阳性及阴性符合率分别为48.6%和28.1%，ERmRNA阳性而ER阴性的占18.7%,ERmRNA阴性而ER阳性的仅占4.3%。PRmRNA与PR的阳性及阴性符合率分别为39.6%、35.9%，PRmRNA阳性的而PR阴性的占22.3%，PRmRNA阴性而PR为阳性的仅占2.2%。经结合临床随访和组织学分级、淋巴结转移等，得到理想结果。现将原位杂交实验流程介绍如下：(一)组织的前处理对组织预处理所用的刀具及容器作清洁处理和灭活RNA酶。将外科或动物实验切取标本切成S1.2x1.0x0.2cm组织块立即冷冻在液氮内储存，或用4%多聚甲醛(用新鲜0.05mol/LPH7.4PBS配制)或中性福尔马林(ddH2O配制，PH7.0)固定，固定时间以24-36小时为宜，避免RNA降减或固定过度。为获得高杂交信号，冰冻切片应切成10pm,切片内如含有脂肪组织应在氯仿内孵育5min,以得到好的切片背景，并干澡切片。石蜡切片厚度为5—7pm，用无RNA酶的防切片脱落的载玻片贴附组织切片。石蜡切片经二甲苯脱蜡，梯度酒精处理（100%、95%、80%）至水化（ddH203x5min）。（二） 杂交的预处理在37°C恒温箱内干燥切片后，滴加5-10pg/ml蛋白酶K,置37°C湿盒内孵育30min,ddH203x5min或4°C75%酒精漂洗5min中止蛋白酶K活性。0.25%醋酸酐10min,经70C2xSSC漂洗、40°C2xSSC各漂洗15min,2xSSC3min,切片经75-100%酒精梯度脱水。注意事项蛋白酶K能消化和暴露被遮蔽的靶核酸，以增加探针的可结合性。蛋白酶K浓度过低，不能使靶核酸有效暴露，浓度过高则组织消化过度，也会影响检测结果。蛋白酶K须用蛋白酶K缓冲液配制（0.1mol/LTris-HClPH8.0,50mmol/LEDTA,经高压灭菌后备用）,蛋白酶K应新鲜配制，低温冰箱内分装保存。蛋白酶K消化组织切片是原位杂交实验流程中重要环节，蛋白酶K浓度应力求准确无误。根据组织类型、固定液的种类，固定时间和切片的厚薄的不同，蛋白酶K浓度也存在差异，选用蛋白酶K最佳消化浓度是原位杂交成功的必要条件，不可省略。（三） 寡核苷酸探针选择和标记常用的寡核苷酸探针对已知靶RNA序列而设计的。特定序列的单一寡核苷酸探针，能与靶mRNA区段的部分序列完全或基本相配对，其长度为19-24核苷酸。这类探针多采用对其5'端进行磷酸化实现。探针通常无须纯化，但是较长的寡核苷酸探针，各片段可能受到污染，应通过聚丙烯酰胺凝胶电泳法将污染的片段除去。（四）预杂交将DEPC处理的切片经ddH2O漂洗2x5min。准备杂交液（3xSSC,1xDenhard's液（0.02%（W/V）Ficoll,0.02%（W/V）小牛血清，0.02%（W/V）聚乙烯吡咯烷酮（polyvinylpyrrolidone）,10%（W/V）葡聚糖，125pg/ml酵母tRNA,100pg/ml变性和剪切的硅鱼精子DNA,10pg/mlPolyadenylcytidyicacid，50%甲酰胺,20mmol/L焦磷酸纳PH7.2）。按组织片大小，每张切片滴加40pl杂交液，置37C温盒内2小时。（五）杂交抖去甩干杂交溶液，用DAKO魔笔沿组织周围划圈，滴加30pl探针杂交液/每张切片（内含20ng地高辛标记的探针），在44C湿盒内孵育过夜。注意事项寡核苷酸探针杂交条件，既要保证杂交特异性的严格性，又要具有能在适当速率下形成稳定杂交体的松动性。一般情况下，用合成寡核苷酸进行杂交的条件要比杂交体的解链温度（Tm）值降低5—10C。这一条件可以减少短探针杂交可能造成假阳性的殓基错配，也会使完全配对的杂交体形成速率降低。短寡核苷酸与靶序列形成的杂交体极易解体，杂交后漂洗必须尽快进行。在使用靶序列完全配对的单一寡核苷酸探针时，杂交条件极易从杂交体的Tm值推得。对短于18个核苷酸的寡核苷酸，将杂交体中A残基数与T残基数和乘以2°C,再将残基G与C残基数的和乘以4C,两积相加便得出杂交体的Tm值。但对于含有较长寡核苷酸的杂交体，采用此法结算的Tm值偏高。注意事项去离子甲酰胺的浓度（deionizedformamidedF）为47%,过高和过低甲酰胺的浓度都会影响杂交结果，当去离子酰胺浓度高于或低于47%,应加ddH2O调整，并根据Longetal1992年报导，计算去离子甲酰胺百分比公式为：％dF=%GC=寡核苷酸G+C殓基量的百分比，L=寡聚核苷酸探针长度，％mismatch=寡核苷酸不能与靶核苷酸配对殓基的百分比，47=杂交温度+10C（在37C下）。杂交液内加入变性剪切的鮭鱼精子DNA在杂交前加入，与其它杂交液分开储存。杂交液能在一20C保存几个月。（六） 杂交后处理1.将切片置37C2xSSC中漂洗2x10min。 2.在37C2xSSC漂洗2x15min、IxSSC漂洗2x15min、0.25xSSC漂洗2x15min均需用振荡漂洗切片。（七） 免疫检测及显色BufferAPH7.5（0.1mol/LTris，1mol/LNaCl，2mmol/LMgCI2,500|jlTween20）冲洗、漂洗各3x5min。用DAKO魔笔沿组织周围划圈，每张切片滴加Streptavidin-AP（链菌素抗生物素-碱性磷酸酶）抗体30pl（1pg/ml）,置37C温盒内1小时。BufferBPH9.5（0.1mol/LTris,1mol/LNaCl,5mmol/LMgCl2）冲洗、漂洗各3x5min。BufferCPH9.5（0.1mol/LTris,0.1mol/LNaCl,5mmol/LMgCl2）冲洗、漂洗各3x5min。每张切片滴加50-100|jl显色液（1mlBufferCPH9.5内含0.33mgNBT+0.16mgBCIP,1mmol/L左旋咪唑在黑暗条件下显色20-40min,显微镜下控制效果。ddH2O中止反应。用核固红复染1-3min,次日在在37C恒温箱内干燥切片15min后，单张切片快速经二甲苯，中性树胶封片。（八）阳性信号的评定原位杂交的阳性信号位于浆内，经NBT/BCIP显色，阳性信号为蓝色，呈细颗粒状。信号越强,颜色越深,呈蓝紫色和紫黑色。阴性对照片内无阳性信号检出。原位杂交的阳性等级按以下方法计算：阳性细胞数：阳性细胞S10%、S30%、＜70%和〉70%分别计1、2、3和4分。阳性着色强度：杂交信号强度可分为弱、中、强三级分别计1、2和3分，上述两种计分相加,1-3分者为阴性,4-5分者为阳性,6-7分者为强阳性。（九）原位杂交的对照原位杂交流程中阴性对照设定:在ERmRNA、PRmRNA的阳性组织片中,在杂交过程中加杂交液不加探针，在免疫检测中不加Streptavidin-AP等，其结果均为阴性。注意事项阳性对照对已知含有丰富靶mRN