噬菌体基因敲除

噬菌体侵染分支杆菌基因敲除实验实验材料与试剂7H9、7H10培养基、TopAgar、牛血清白蛋白（BSA）、潮霉素、胰蛋白胨、酵母提取物、琼脂粉、Tris、SDS、卡那霉素、西班牙琼脂糖（Biowest）、GlodviewDNA染料Van91I、AlwNI、PflMI、PacI、Tween-80、T4DNA连接酶、EcoRI、Hindlll、BamHI、TransT叫HiFiDNA酶（含dNTPS）、Trans2KPlusDNAMarker、九DNA/HindIIIDNAMarker、DNAMarkerIII、普通质粒小提试剂盒、琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒、冰醋酸、氯仿、无水乙醇、甘油、乙二胺四乙酸⑴口1人）、CaCl2、MgCl2、HCl、NaCl、葡萄糖、异丙醇。主要试剂配置方法：①ADS：50gBSA,20g葡萄糖，8.5gNaCl定容到1L蒸馏水中，用0.22mmMillipore滤膜过滤后，放于4℃冰箱备用。②7H9液体培养基：4.7g7H9溶于900ml蒸馏水中，混匀，加入10ml50%（质量体积比）甘油，120℃高压灭菌20min，冷却后加入100mlADS，放于4℃冰箱备用。使用时每40ml7H9培养基需加入100Ml20%Tween-80。③7H10固体培养基：19g7H10溶于900ml蒸馏水中，混匀，加入10ml50%（质量体积比）甘油，120℃高压灭菌20min，冷却后加入100mlADS，到平板。TopAgar：0.4g7H9，0.75gagar溶于100ml蒸馏水中，120℃高压灭菌20min，冷却后加入1ml20%葡萄糖（0.22口mMillipore滤膜过滤），备用。MPbuffer：pH7.6Tris-Cl50mM，Nacl150mM，MgCl210mM，CaCl22mM。Extractbuffer：pH7.8Tris-HAc40mM，NaAc20mM，EDTA1mM,1%SDS。实验用菌株：耻垢分枝杆菌标准株（mc2155）、大肠杆菌DH5a、大肠杆菌HB101。1重组打靶片段的构建载体构建载体p0004上具有四个Van91I酶切位点，且具有后期包装噬菌体所需要的cos位点。用Van91I限制性内切酶酶切p0004,回收1.6kb和3.6kb目的片段（即去除结构图上的LR两片段）。目的基因克隆(1)PCR扩增MSMEG_1804基因左右臂，引物如下：MSMEG_1804L(AlwNI，996bp)MSMEG_1804LFTTTTTTTTCAGAAACTGAAGACGACCCGTGAGGGTAMEMEG_1804LRTTTTTTTTCAGTTCCTGATGTCGAGAACGTCTGCGTMSMEG_1804R(AlwNI，1008bp)MSMEG_1804RFttttttttcagagactgTGCTGGCCAAGTCGCTMSMEG_1804RRTTTTTTTTCAGCTTCTGTGGGAACACGATGGAACCT(2)PCR扩增MSMEG_2415基因左右臂，引物如下：MSMEG_2415L(PflMI，791bp)MSMEG_2415LLTTTTTTTTCCATAAATTGGTTCAACAGCGACCTCGTGACMSMEG_2415LRTTTTTTTTCCATTTCTTGGTGTGCTGATCGGTGAGAAACMSMEG_2415R(PflMI，996bp)MSMEG_2415RFTTTTTTTTCCATAGATTGGATCGGCTCGGCCCTGAAMSMEG_2415RRTTTTTTTTCCATCTTTTGGTTCGCATGCGTCGCCATA(3)通过切胶回收目的片段，步骤如下：i从琼脂糖凝胶中将单一的目的DNA条带胶切下放入干净的离心管中，称取胶块质量。正向胶块中加入3倍体积溶胶液PN。50℃水浴放置10min,其间不断温和地上下翻转离心管，以确保胶块充分溶解。iii将上一步所得溶液加入吸附柱CA2中(吸附柱放入收集管中)，室温放置2min,12000rpm离心Imin,弃掉收集管中液体。次向吸附柱内加入600pl漂洗液(使用前按要求加入适量无水乙醇)，室温静置2min,12000rpm离心1min,弃掉收集管中液体。▽向吸附柱内再加入600Pl漂洗液，12000rpm离心1min,弃掉收集管中液体，再离心2min,弃掉收集管，将吸附柱放入ep管中，65℃烘干，防止残留的漂洗液影响下一步洗脱效果。5向吸附柱中心加入30Pl蒸馏水，室温放置2min,12000rpm离心2min,弃掉吸附柱，于ep管上做好标记。(4)用限制性内切酶AlwNI酶切MEMEG_1804LR,PflMI酶切MEMEG_2415LR,37℃3hr,然后用等体积异丙醇-20℃沉淀15min,12000rpm离心10min,弃上清，70%乙醇1ml洗一次，12000rpm离心10min,烘干，溶于15Pl蒸馏水中，用琼脂糖凝胶电泳验证目的片段回收效果。1.3敲除载体构建（1）连接目的基因左右臂片段和p0004回收两片段，连接产物经热转化转入DH5a感受态细胞。由于p0004的3.6bp片段含有潮霉素抗性基因，故用含潮霉素（150口g/ml）的LB平板筛选单菌落。（2）提取筛选单菌落质粒，步骤如下：i取4ml过夜培养的菌液于离心管中，12000rpm离心Imin,收集菌体，向菌体内加入250Ml溶液P1（使用前加入规定量的RnaseA,重悬菌体并混匀。正向离心管中加入250Ml溶液P2,温和的上下颠倒6-8次混匀，使菌体充分裂解。出向离心管中加入350Ml溶液P3,立即上下颠倒6-8次温和混匀，12000rpm离心10min,取上清于吸附柱CP3中（吸附柱放入收集管中），室温静置2min,12000rpm离心1min,弃掉收集管中液体。次向吸附柱内加入600ml漂洗液（使用前按要求加入适量无水乙醇），室温静置2min,12000rpm离心1min,弃掉收集管中液体。▽向吸附柱内再加入600Ml漂洗液，12000rpm离心1min,弃掉收集管中液体，再离心2min,弃掉收集管，将吸附柱放入ep管中，65℃烘干，防止残留的漂洗液影响下一步洗脱效果。5向吸附柱中心加入50Ml蒸馏水，室温放置2min,12000rpm离心2min,弃掉吸附柱，于ep管上做好标记。（3）提取质粒送出测序，验证目的基因左右臂是否正确插入到p0004载体中，完成敲除载体的构建。噬菌体体外包装和转导本实验用phAE159质粒含有分支杆菌噬菌体的编码信息，用限制性内切酶PacI分别酶切phAE159和测序质粒，连接两片段，通过噬菌体体外包装步骤，转化入HB101感受态，用含潮霉素（150Mg/ml）的LB平板筛选单菌落，提取质粒经PacI酶切验证得到穿梭载体phasmid，经由电转化转入mc2155感受态中，电转后加入1ml7H9培养基（不含Tween-80）室温复苏1hr，与新鲜培养至OD600为0.6-0.8的mc2155菌液混合，加入到3ml融化的TopAgar中，平铺到7H10平板上，于30℃培养3天，挑选噬菌斑。扩增噬菌体，利用同源重组进行基因敲除噬菌体扩增取噬菌斑溶于50微升MPBuffer，室温1hr，放入4℃过夜。取300Mlmc2155与3mlTopAgar混匀，平铺到7H10平板，待Agar凝固后，离心过夜溶于MPbuffer的噬菌斑，取3Ml上清点到上述平板上，30℃培养2天，由于噬菌体具有在30℃裂解生长的特点，通过裂解宿主细菌，达到扩增噬菌体的目的。两天后取扩增后的噬菌斑溶于200MlMPbuffer，室温1hr，4℃过夜，离心，取5Ml上清液，加入到300Mlmc2155中，再与3mlTopAgar混匀，平铺到7H10平板，30℃培养2天，继续扩增噬菌体。两天后加入4mlMPbuffer与上述平板中，4℃过夜溶出噬菌体，回收上清液用0.22Mm的Millipore滤膜过滤，梯度稀释测定噬菌体的滴度，当达到1010/ml时，可以用来进行基因敲除。利用同源重组进行基因敲除（1）从4℃冰箱的种子液中按1%接种量传代培养mc2l55，至OD600为0.6-0.8（2）取2ml菌液，12000rpm离心1min，弃上清，用1mlMPbuffer清洗菌体两次，12000rpm离心1min后弃上清液，菌体用200pl7H9培养基（不加Tween-80）重悬。（3）取100Pl滴度达1010/ml的噬菌体与100Pl上述处理菌液混匀，37℃静置3hr后，全部涂布在含潮霉素（75pg/ml）的7H10