内毒素检测进展课件

第四军医大学西京医院检验科细菌室樊新内毒素检测进展及临床意义1

内毒素（Endotoxin,ET）是革兰氏阴性细菌细胞壁的主要成分，其化学成分为脂多糖（Lipopolysaccharide，LPS），由类脂A、核心寡聚糖O及多糖侧链组成。2一、内毒素的产生，作用机理及

生物学效应内毒素的产生

以往认为ET作为细胞壁的结构成分只有在菌体死亡或人工裂解时才能释放出来。但近年来发现革兰氏阴性杆菌在细菌对数生长期或细菌营养缺乏时也可以以“出疱疹”的方式被释放ET。3

内毒素的作用机理LPSLPS-LBP（LPS结合蛋白）LPS-SCO14（细胞膜上的受体）信号传递信号传递CD14+细胞（Mф，PMN，单核核细胞）CD14－细胞（上皮细胞等）吞噬作用杀菌活性一级介质释放粘附分子表达→细胞反应5TNF、IL-1IL-6、IL-8瀑布样反应，全身炎性反应综合症急性炎症PG、TXA、LTC、PAG、C5a、O2-、NO，弹力酶（二级介质）脓毒综合征（发热、低温、心动过速、尿少、酸中毒、低血压）DIC内毒素休克MOSF（多器官功能衰竭）死亡6内毒素的生物学效应发热反应白细胞反应内毒素血症（ETM）与内毒素休克（ETS）弥漫性血管内凝血（DIC）

7二、内毒素的检测目前内毒素检测的方法主要有：鲎试验

ELISA法结合免疫鲎试验法（IML）自动化动力学方法化学发光法光纤维生物传感法毛细管电泳法8

①标本颜色的深浅可使敏感性偏低；②受血浆中LPS抑制因子的干扰；③非特异性凝血酶、凝血活酶、核糖核酸酶、胰蛋白酶等均可使鲎变形细胞溶解物产生假阳性反应；④LT法的标准化问题（目前国际尚无统一标准）。10结合免疫鲎试验法（Immunolimulus,IML）

以广泛交叉反应性抗LPS－McAb（Wn1222-5）来捕获LPS，再与鲎试剂反应，可定量检测样本中肠杆菌科细菌感染所释放的LPS，敏感性可达100pg/ml。该法以抗LPS单克隆抗体为探针使内毒素血症检测特异性得以改善，且不受标本浊度、放置时间、抑制因子等非特异性因素的影响，但仍不能避免鲎试剂自身因素的影响。12

该方法对LPS的定量范围为10~100pg/ml。反应中所用产色鲎试剂不含G因子，因此可避免与标本中存在的真菌发生凝固作用而出现非特异性反应，其优点还体现在标本先用碱处理，从而克服了鲎试剂内的一些影响因素。14化学发光法

利用CR1和CR3受体诱导中性多核粒细胞中的氧化产物作为检测平台，依靠LPS－LPS抗体复合物使全血中的中性粒细胞所释放的氧化物质，引起补体调理酵母多糖，导致发光物质（CL）氧化而发光，通过仪器光学系统检测发光的强度而定量测定血中的内毒素，对LPS定量范围为20~200pg/ml。该法对大多数革兰氏阴性杆菌的LPS有广泛的反应性，而对革兰氏阳性菌、曲霉菌等无反应，可望成为临床诊断内毒素血症的有用工具。15光纤维生物传感法利用短波光纤维生物传感器检测LPS，最低敏感性为10ng/ml，可在30s内完成。其原理是共价结合于光纤维探针表面上的多粘菌素B可选择性地结合荧光标记的LPS，未标记的LPS在竞争试验中根据已标记的LPS产生的荧光强度得以定量检测。此法不仅应用于临床而且还可应用于环境中LPS的检测，该法虽快速简便，但敏感性不如IML法和ELISA法。16毛细管电泳法

LPS是缺乏有旋光力的基团，检测其未衍化的状态比较困难。硼酸盐可与LPS分子的二乙基结合使其旋光力增强，采用UV活性多粘菌素B与LPS形成复合物或荧光素异硫基氟酸盐标记LPS亦可达到目的。方法是将处理过的标本吸入毛细管，用标准磷酸盐缓冲液（100mg/ml）做电泳，6min内即可完成检测。此法敏感性为35pg/ml，但电泳的条件不易掌握，且易受某些技术因素或固有误差的影响，目前尚难以推广应用。17MB－80内毒素测定系统内毒素葡聚糖

微生物快速动态检测仪18检测原理主要原理与鲎试验的反应原理相同：利用革兰氏阴性菌脂多糖激活酶反应主剂A中的相应因子后形成凝固蛋白，根据其引起的浊度变化对革兰氏阴性菌脂多糖浓度进行定量测定。20三、内毒素检测的临床意义正常参考值：正常人血浆内毒素含量<10pg/ml。革兰阴性菌败血症的诊断:通过测定人血浆中的内毒素即可对G－菌所引起的临床菌血症及败血症进行确诊，而且对病原菌的分辨及各种感染症状治疗及预后判定都具有很大帮助。21肝脏感染甲肝：甲肝的内毒素血症发生率为58％，平均内毒素浓度为54.7pg/ml。在发病的前3周内毒素最低水平为37.7pg/ml。5周后开始恢复正常。乙肝：急性乙肝内毒素血症的发病率占51.9%，随着病情的缓解内毒素水平逐渐下降。慢性活动性乙肝时出现内毒素血症者占53.7%，并且有80％的患者持续存在内毒素血症。丙肝：慢性活动性丙肝的内毒素血症发病率最高（>80%），而且血清丙氨酸转氨酶水平与内毒素血症发生率及含量无明显关系。23肝硬化：肝脏可摄取血流中内毒素的80~90%，由于肝硬变后造成的肝枯否氏细胞清除能力下降及肝内组织结构和血流的改变，肝内毒素摄取减少，造成严重的内毒素血症。胆道疾病：胆石症伴胆囊炎的内毒素血症的发生率为78％；化脓性胆管炎为20％；梗阻性黄疸的程度与内毒素浓度以及持续时间有一定关系，术后的内毒素血症发病率为50％~75%，是术后出现并发症和患者死亡的一个重要原因。24细菌性感染的辅助诊断、治疗和预后判断全身性细菌感染：全身性细菌感染主要见于败血症。革兰氏阴性细菌性败血症常并发内毒素血症。这种败血症较常见的致病菌为沙门氏菌属、脑膜炎双球菌属及拟杆菌属。这些致病菌多通过泌尿道、肠道、胆道及呼吸道而引起感染，也可通过外伤、外科手术、导管检查或留置，以及器械操作等途径而进入血液，并大量繁殖引起败血症，从而造成内毒素血症。26局部性细菌感染：局部性细菌感染造成内毒素血症的有肺炎、胆囊炎、烧伤合并感染、穿孔性腹膜炎、化脓性胆管炎、肝脓肿、肾盂炎、卵巢囊肿扭转伴尿路感染、肠结核及肺结核伴绿脓杆菌感