乙肝疫苗的制备

基因工程

－乙肝疫苗的制备

演讲者：鞠林PPT制杨秀兰李翠华欧永银资料提供者：鞠林刘珍王伟杰彭博周永斌李凯向运新朱晓东第一页，共二十二页。基因工程

定义：又称为重组DNA技术，指将某些特定的基因或DNA片断，通过载体或其它手段送入受体细胞，使它们在受体细胞中增殖并表达的一种遗传学操作。是生产出符合人类需要的产品或创造出生物的新性状并能稳定遗传。

作用：可把来自任何生物的基因转移到与其毫无关系的任何其他受体细胞中，可以任意改造生物的遗传特性，创造出生物的新性状。某一段DNA可在受体细胞内进行复制，为制备大量纯化的DNA片段提供了可能.第二页，共二十二页。获得目的基因表达载体重组的表达载体酶切、连接宿主细胞转化、转染等原核生物细胞植物细胞动物细胞卵细胞培养的动物细胞转基因动物胚胎发育药物、疫苗转基因植物转基因微生物基因工程药物人类细胞基因治疗第三页，共二十二页。蛋白质名称用途促肾上腺皮质激素〔adrenocorticotrophichormone〕治疗风湿〔rheumaticdisease〕B细胞生长因子〔B-cellgrowthfactor〕治疗免疫系统功能失调降钙素(calcitonin)治疗软骨病(osteomalacia)集落刺激因子(colonystimulatingfactor)治疗血液病、肿瘤辅助治疗绒毛膜促性腺激素(chorionicgonadotropin)治疗不排卵症内啡肽和脑啡肽(endorphineandenkephalin)镇痛剂(analgesicagent)上皮生长因子(epidermalgrowthfactor)促进伤口愈合红细胞生成素(erythropoietin)治疗贫血(anemia)凝血因子Ⅷ(factorⅧ)治疗血友病(hemophilia)凝血因子Ⅸ(factorⅨ)治疗血友病生长激素(growthhormone)促进生长生长激素释放因子(growthhormonereleasingfactor)促进生长胰岛素(insulin)治疗糖尿病(diabetes)干扰素(interferon)抗病毒抗肿瘤白细胞介素(interleukin)治疗癌症第四页，共二十二页。第五页，共二十二页。基因重组乙肝疫苗用基因重组技术把乙型肝炎病毒的外表抗原〔HbsAg〕基因片段插入酵母细胞或哺乳动物细胞的基因中，在体外培养增殖过程中组装或分泌出乙型肝炎外表抗原，然后把外表抗原收集起来提纯之后做成乙型肝炎疫苗。第六页，共二十二页。乙肝疫苗的制备第七页，共二十二页。目的基因的获取编码乙型肝炎外表抗原的基因的获取

一般的目的基因的获取方法有：反转录法化学合成法反转录—聚合酶链反响法cDNA文库的建立？第八页，共二十二页。cDNA文库的建立第九页，共二十二页。工程菌的构建CHO细胞的特点①具有准确的转录后修饰功能,表达的糖基化药

物蛋白在分子结构、理化特性和生物学功能方面最接近于天然蛋白分子②具有产物胞外分泌功

能,便于下游产物别离纯化;③具有重组基因的高效

扩增和表达能力;④具有贴壁生长特性,且有较高的

耐受剪切力和渗透压能力,可以进行悬浮培养,表达水平较高;⑤CHO细胞属于成纤维细胞(fibrob2last),很少分泌自身的内源蛋白,利于外源蛋白的后别离第十页，共二十二页。材料菌株﹑质粒及细胞大肠杆菌DH5α和质粒pMD18-Sm〔携带改变稀有密码子后的S基因〕质粒pCIneoCHO／dhfr-细胞pMD18-T载体第十一页，共二十二页。主要试剂限制性内切酶、T4DNAligase、质粒DNA提取

和柱式胶回收试剂盒乙型肝炎外表抗原检测试剂盒DMEM和透析胎牛血清胰蛋白酶、氨甲喋呤〔MTX〕和脂质体LipofectamineTMHBsAg血凝检测试剂盒第十二页，共二十二页。

目的基因的表达第十三页，共二十二页。蛋白质的别离纯化第十四页，共二十二页。浓缩与初步纯化离子交换层析疏水层析亲和层析固液别离离心沉淀膜过滤双水相萃取高度纯化DNA的去除热原质的去除病毒的去除第十五页，共二十二页。别离纯化的根本要求技术条件温和，保持其生物活性选择性好，到达有效别离纯化的目的技术间可以直接连接，节省工艺步骤收率高，过程快选择别离纯化方法的依据根据产物表达形式来选择根据别离单元之间的衔接来选择根据别离纯化工艺的要求来选择第十六页，共二十二页。别离纯化工艺流程第十七页，共二十二页。1、发酵液的预处理连续高速离心，除去细胞残片，再超滤浓缩2、疏水柱层析介质：ButylSSepharoseFF参加适量硫酸铵，调节电导率与柱层析平衡液电导率相等按照平衡柱床、上样吸附、平衡液洗柱、降低硫酸铵浓度解析、清柱再生程序层析

第十八页，共二十二页。3、阴离子交换柱层析介质：DEAESepharoseFFHBsAg活性蛋白经SephadexG-25柱脱盐换液，使缓冲盐系统的PH、离子强度和IEC平衡液一致按照平衡柱床、丄样吸附、氯化钠浓度梯度分段洗脱、清柱再生程序层析第十九页，共二十二页。4、凝胶过滤柱层析介质：Sepharose4FF超滤浓缩到适当体积按照平衡柱床、丄样、洗脱程序层析5、除菌收取到的HBsAg除菌过滤，即为纯品第二十页，共二十二页。谢谢欣赏第二十一页，共二十二页。内容总结基因工程。是生产出符合人类需要的产品或创造出生物的新性状并能稳定遗传。某一段DNA可在受体细胞内进行复制，为制备大量纯化的DNA片段提供了可能.。一般的目的基因的获取方法有：。②具有产物胞外分泌功

能,便于下游产物别离纯化。胰蛋白酶、氨甲喋呤〔MTX〕和脂质体LipofectamineTM。连续高速离心，除去细胞残片，再超滤浓缩。按照平衡柱床、丄样、洗脱程序层析。谢谢欣赏第二十二页，共二十二页。观察思考想一想我们在需要吃这些药品时应该注意些什么呢？医生在治病时，最常见的就是给病人吃口服药。你知道吗？需要吃药时，一定要遵医嘱用药啊！因为吃药的学问可大啦！仔细观察上面两张图片中的药品，你能说出它们之间有什么区别吗？如果药品的服用方法和服用时间不正确，与饮食的搭配不合理，不仅不利于药效的发挥，还可能导致各种意想不到的危险，所以，药品应慎用！

通过观察上面两张图片中的药品，从常见的剂型来看，口服药主要分为冲剂、片剂和胶囊，它们服用时的喝水方法区别如下：（1）冲剂是在中医汤药的基础上发展而来，用水冲开后即相当于煎好的汤剂。例如饮用感冒清热颗粒等中药冲剂，每次可用150毫升水冲开服下，再用一口水漱漱口即可。（2）片剂通常用150—200毫升水送服，用水太多会稀释胃液，加速胃排空，反而不利于药物的吸收。例如用于治疗脾胃虚弱、消化不良的健胃消食片，服用时甚至可以咀嚼。（3）胶囊是用胶质把药品装起来，以保护药物、遮盖异味以及改变溶解速度或溶解位置。为防止服用后胶囊附着在食道壁上，造成损伤甚至溃疡，所以，送服时一定要多喝水，其饮水量往往是片剂的1.5—2倍，以保证药物确实被送达胃部。例如在服用治疗暑湿感冒、头痛发热、呕吐泄泻的藿香正气胶囊时，除多喝水外，还应注意咽下时应稍稍低头，这样，胶囊就会更顺利地服下了。注意：特殊药物需水量更大！读一读吃药有大讲究按时吃药，非常重要。很多因素决定服药时间，比如要考虑让药品能及时地在胃肠道里被吸收，或者为让药品可以安全地进入血液；有时要考虑减少药品对消化道的伤害，或者为避免药物之间的交互作用以及避免药物副作用等。饭前服药：指饭前一小时，或饭后两小时；饭后服药：指饭后一小时以内；服用抗生素类药物要间隔4小时或6小时，主要是为了使药品在血液中维持一定的浓度，以达到治疗效果。

吃药时间吃药与饮食服药期间不合理的饮食会降低药效，严重的还可能危及生命。一些常用药物服用期间的饮食禁忌如下：

降血压药、抗心绞痛药——忌喝西柚汁、忌吃含盐高的食品。因为西柚汁中的柚皮素可以影响肝脏中某些酶的作用，而这种酶恰与降血压和抗心绞痛药物的代谢有关。而食盐则会引起血压升高，降低降压药的疗效，同时加重心绞痛的程度。抗抑郁药、抗结核药——忌吃奶酪、香蕉、油梨、豆浆等含酪胺较多的食物。这类药的作用机理是抑制体内的单氨氧化酶。但这种酶抑制剂易与酪胺发生反应，产生去甲肾上腺素，聚集过多产生多种不良症状。苦味健胃药、助消化药、中药——忌吃糖或甜食。糖或甜食会掩盖苦味，并与中药内的很多成分发生反应，减少有效成分含量，降低药效。

其实服药期间的饮食禁忌可多啦，千万不能小视呀！

实践探究

思考：家庭小药箱中的常用药品服用方法1．利用节假日的休息时间，邀请父母一起讨论。2．把手清洗干净后，从家庭小药箱中，找出家庭成员常用的口服药物。3．分别选出冲剂、片剂和胶囊等常见剂型，看一看药品的名称、功能主治、用法用量、注意事项等。4、比较冲剂、片剂和胶囊的服用方法，做出判断。5、在练习本上完成下表，然后与父母进行交流。

读一读因服药不慎造成头痛、恶心甚至昏迷等药物中毒症状后，一定要立即拨打120，采取催吐、人工呼吸等措施，并急送医院抢救。

1．调查：在药店销售的药品中，常见的冲剂、片剂和胶囊等分别有哪些？这些常见的口服药可以治疗哪些疾病？2．结合药品分类的内容，在练习本上完成下表：学以致用药品名称药品类别服药需水量服药时间注意事项板蓝根颗粒冲剂150ml饭后一小时不适用于风寒感冒者健胃消食片片剂150ml饭前饭后阿奇霉素胶囊胶囊300-400ml饭前一小时，或饭后两小时磺胺类片剂300毫升饭后一小时中药字典之二法，最常用的炮制方法被概括为烘、炮、炒、洗、泡、漂、蒸、煮“八法”。正像这些汉字所展示的那样，前三种方法用火，其后三种用水，最后两种水火兼用，故统称为“水火之剂”。此外还有用酒、蜜、醋、盐等辅料进行加工的方法。多数药材是利用药碾将药材研碾为细末，以便进一步制作丸、散、膏、丹等成药。中药字典之三

无论是碾压粉碎，还是酒蒸土炒，都既是炮制加工的过程与方法，同时也是药效构成的组成要素。例如在今本《黄帝内经》中，有一个治疗因脉道