法医遗传的运用论述

法医遗传的使用论述基因组印记基因组印记是一种不遵循传统孟德尔遗传规律的表观遗传现象。这是因为来源于某一亲本的等位基因或其所在的染色体发生了表观遗传修饰，导致不同亲本来源的两个等位基因在子代细胞中表达不同。受印记机制调控而差异表达的基因称之为印记基因(imprintedgene)。当前在植物、昆虫和哺乳动物中均发现了基因组印记现象，而在鸟类、鱼类、爬行类和两栖类动物普遍认为不存有印记现象。1991年Bartolomei等采用基因敲除技术在小鼠中首次确认了类胰岛素生长因子2型受体和非编码RNAH19基因两个母源印记基因及一个类胰岛素生长因子2型父源印记基因。2007年，杜克大学的研究人员用机器学习的人工智能形式发现了156个新的印记基因，并以此为基础创造了第一张人类基因组印记基因图谱。X染色体失活X染色体失活是指雌性哺乳类细胞中两条X染色体的其中之一失去活性的现象，X染色体会被包装成异染色质，进而因功能受抑制而沉默化，这种现象也称为X染色体的剂量补偿(dosagecompensation)。X染色体失活的起始和选择发生在胚胎发育的早期，这个过程被X染色体失活中4(X-inactivationcenter，XIC)所控制，是一种反义转录的调控模式。这个失活中心存有着X染色体失活的特异性转录基因，当失活命令下达时，这个基因产生1个17kb不翻译的RNA与X染色体结合，介导DNA甲基化和组蛋白修饰，引发并维持X染色体的失活。X染色体失活中心还有“记数”功能，即保持每个二倍体中仅有1条X染色体有活性，其余全部失活。X染色体的失活状态需要表观遗传修饰来维持，能够通过有丝或减数分裂遗传给后代。非编码RNA非编码RNA是指不能翻译为蛋白质的功能性RNA分子，其中包括rRNA、tRNA、snRNA、snoRNA、microRNA等多种已知功能的RNA以及未知功能的RNA。按照它们的大小可分为长链非编码RNA和短链非编码RNA，前者在基因簇以至于整个染色体水平发挥顺式调节作用，后者在基因组水平调控基因表达并介导mRNA的降解，诱导染色质结构改变，决定细胞的分化命运，还对外源的核酸序列有降解作用以保护本身的基因组。microRNA是一类内源产生的长度约为22个核苷酸的非编码小RNA分子，广泛存有于真核生物甚至病毒中，通过调节编码蛋白的基因的表达或翻译来发挥调控作用。microRNA的功能十分广泛并且渗入到了生理病理学的各种调控途径中，包括发育周期、细胞增殖和分化、细胞凋亡、新陈代谢、神经调控、肿瘤发生以及病毒和宿主的相互作用等。在法医学应用中，因为降解后的片段长度过小，不能实行有效的PCR扩增，不过microRNA就能满足降解检材的PCR扩增，开始成为注重的热点。表观遗传学在法医学中的应用1表观遗传学与亲权鉴定自1985年英国遗传学家AlecJeffreys教授首次报道DNA指纹图技术应用于法医DNA分析以来，DNA分析技术已经在多起重大的刑事犯罪侦破和民事诉讼中发挥重要的作用。当前主要是以荧光标记STR与SNP等传统遗传标记实行个体识别和亲权鉴定。但在法医学亲子鉴定中，尤其是子代为杂合子或者父（母）和子代为相同的杂合子的单亲鉴定中，亲代的必需等位基因可能无法确定，使基因座的鉴别水平下降。但通过使用亲缘特异性甲基化遗传标记能够直接判定等位基因的亲源，从而确定亲代的必需等位基因。Zhao等应用甲基化特异性PCR对被甲基化标记的母系SNP位点rs220028实行检测证明了这个观点。另外，Poon等报道，采用DNA甲基化标记可有效识别孕妇外周血中的胎儿DNA，这也为产前的亲权鉴定提供了一种非侵入性的检测方法。2表观遗传学与年龄推断鉴定个体年龄推断一直是法医学研究的重要内容。当前实际工作中，个体年龄推断主要依据人类学方法，通过测量与年龄相关的骨骼、牙齿标志等，根据相关模型实行推算。近年来，很多研究者发现表观遗传学为个体年龄推断的研究提供了一种新的思路。DNA甲基化随年龄变化的特点为利用甲基化标记实行年龄推断提供了可能。陈培利等利用人胚肺二倍体成纤维细胞(humanembryoniclungdiploidfibroblast，2BS)实行体外培养，发现其P16基因启动子区及外显子I处的DNA甲基化水平随个体细胞代龄的增加而降低。Tra等用限制性标记基因组扫描(restrictionlandmarkgenomescanning,RLGS)技术对T淋巴细胞2000个基因座的甲基化年龄变化情况实行了调查，发现29个基因座有变化，其中23个增加，6个降低。因为甲基化标记数目众多，从中能够筛选出一组适合于法医学应用的、年龄变化有规律的座位，应用于微量检材的年龄推断。尹慧等用高效液相色谱(HPLC)法对94个健康个体DNA甲基化水平的检测发现，5-甲基胞嘧啶(5-methylcytosine,5mC)含量随年龄增加而降低，50岁以上与50岁以下年龄组5mC含量差异具有统计学意义。2010年，Teschendorff等通过对261个绝经后妇女全血样本约14000个基因启动子区超过27000个CpG的甲基化状态实行分析，证实干细胞多梳蛋白家族(polycombgroup,PcG)靶基因比非靶基因更容易随年龄发生甲基化，并且变化不依赖于组织类型、疾病状态和甲基化水平。Bocklandt等通过度析唾液中的DNA甲基化标记，能够预测一个样本组成员的年龄，结果与实际年龄相差大约在5岁范围内。这项技术如果被确证，可能会成为法医取证方面很有用的一种工具。同时，它还表明了一种可能性：DNA甲基化修饰或许能够提供一种比计算生日更具医学相关性的年龄测定方法。2010年，NorenHooten等在外周血单核细胞中的800个microRNA标记中筛选出9个与年龄相关的基因，但发现其中5个与疾病相关，该研究表明microRNA能够作为推断年龄以及和年龄相关疾病的诊断指标。2011年，国内Jin等首次报道了通过体细胞发挥功能的组蛋白修饰基因对衰老这个重要生物学过程的调控作用。这项研究通过生物化学、分子生物学、遗传学和系统生物学相结合的方法，发现组蛋白H3K27me2/3去甲基酶UTX-1/UTX对衰老发挥了重要的调控作用。在秀丽线虫中，该基因的杂合突变体及野生型的RNAi敲降后都能极大地延长线虫寿命，使其抗逆性也大大增强。遗传学分析发现其功能依赖于胰岛素样信号通路。这种通过重新建立组蛋白修饰模式的方式，揭示了细胞的重编程在抑制衰老过程中的重要作用，并提示其作用机制在哺乳动物细胞中同样存有。3表观遗传学与双生子的鉴别同卵双生子(monozygotictwins，MZ)是由一个受精卵经过卵裂产生两个单独的细胞，并发育为完全独立的个体，所以同卵双生两个个体的遗传背景完全相同，享有共同的DNA序列。在法医DNA分析领域，现有的DNA分析手段尚不能有效鉴别同卵双生个体。但是近年来，众多研究都已证实，同卵双生子的表观遗传学水平存有一定的差异。Fraga等对西班牙的40对同卵双生子个体实行研究，发现他们在DNA甲基化、X染色体失活、组蛋白位点特异性乙酰化上存有差异，并且这种差异会随年龄增长而增加。Kaminsky等对114对同卵双生子个体的DNA甲基化的研究显示，血白细胞、口腔黏膜上皮细胞和肠道组织中的甲基化状态均存有差异。止匕外，Ollikainen等对新生儿不同组织相关的4个差异甲基化区域的甲基化状态实行了研究，发现甲基化水平存有显著差异。从上述研究成果中能够看出，研究人员已经把目光投入到了法医DNA分析的全新领域，尤其是DNA甲基化在同卵双生子中的研究。这些都为采用DNA甲基化这个表观遗传学标记实行同卵双生子个体甄别的可能性提供了强有力的理论支撑。4表观遗传学与组织来源鉴定在常见的法医学案件中，有时需要对生物检材的组织来源实行鉴定。传统的形态和生化方法信息含量少，容易受各种条件的影响，所以常常受到限制。随着分子生物技术的发展，以表观遗传学为基础的组织鉴定方法存有明显优势，越来越为人们所注重。例如，富含CpG的Alu重复序列，在体细胞中是甲基化的，在生殖细胞中却是低甲基化的，有一个在进化上比较年轻的Alu亚族在精子中几乎是完全没有甲基化的。通过对这个Alu亚族甲基化的分析，就能够判断检材是否含有精子。范光耀应用联合亚硫酸氢盐的限制酶法，调查精液、常见体液、分泌液和组织的DEAD盒多肽4[DEAD(Asp-Glu-Ala-Asp)boxpolypeptide4,DDX4)]基因启动子甲基化水平，发现精液中的甲基化水平显著高于非精液组织。所以，选择一个合适的界值，能够根据DDX4甲基化水平有效地鉴别精液(斑)的种属来源。Hanson等使用RT-PCR技术，根据microRNA的细胞组织特异性对血液、精液、唾液、阴道分泌液和经血实行来源鉴别，并通过与21种人体组织比对验证了各种斑痕microRNA表达的特异性，用于检测RNA的模板量最低可达50pg。Zubakov等使用微阵列和Taqman定量PCR技术确证了一些能使用于法医学实践识别血痕和精斑的稳定的microRNA标记。该项研究不但将灵敏度提升到相当于单细胞水平的0.1pgRNA模板量，而且在新鲜与陈旧样本的比对中发现其microRNA分子绝对含量未发生明显变化。5其他近年来，随着学者们对RNA在法庭科学领域的研究逐渐广泛和深入，发现microRNA在法医学领域的应用价值也日益重要。2007年王芬等发现有6个microRNA分子在H2O2诱导PC12细胞凋亡后表达显著下调，这个结果为法医病理学者研究脑缺血再灌注损伤中神经细胞凋亡的机制提供了理论依据。2010年李文灿等在研究大鼠心肌组织microRNA降解与死亡时间的相关性时发现，其含量在机体死后120h内保持相对稳定的水平，可作为内参指标反映其他生物指标的变化水平。随着分子生物学技术的飞速发展，法医工作者又面临一项新的挑战，即如何在日常的亲缘鉴定和个体识别工作中有效甄别伪造DNA。用于伪造DNA常使用PCR扩增的方法，所以使用亲缘特异性甲基化遗传标记，能够在实行亲子鉴定和个体识别的同时，检测样本的甲基化状态，从而鉴别样本是否为人工伪造DNA。所以DNA甲基化遗传标记在鉴定DNA是否人工伪造中发挥着重要的作用。