叶酸代谢能力基因检测操作流程

叶酸代谢能力基因检测操作流程叶酸代谢能力基因检测操作流程叶酸代谢能力基因检测操作流程叶酸代谢能力基因检测操作流程编制仅供参考审核批准生效日期地址：电话：传真:邮编:MTHFRC677T,MTHFRA1298C,MTRRA66G基因检测操作流程实验流程一、操作步骤适用仪器：普通PCR仪样本要求：EDTA抗凝剂的静脉全血（100µl），室温保存不超过7天，2～8℃保存不超过1个月，-20℃保存不超过3个月，反复冻融次数不超过5次；DNA的浓度应不低于5ng/μl，A260/A280应在~之间。有血块的样本需经匀浆处理或用组织研磨仪研磨处理后再进行全血DNA的提取。检验方法：（试剂盒中的检本测卡、阳性/阴性对照卡上标识解释如下：M表示突变型，WT表示野生型，C表示质控线，T表示检测线。）A：样本DNA的制备试剂盒准备工作：1、清洗液BW-I：用50ml量筒分别移取35ml无水乙醇（分析纯）和35ml异丙醇加入至清洗液BW-I试剂瓶中，颠倒混合均匀，在试剂瓶上标明“已加入醇”和日期，备用。2、清洗液BW-II：用50ml量筒移取49ml无水乙醇加入至清洗液BW-II试剂瓶中，颠倒混合均匀，在试剂瓶上标明“已加入醇”和日期，备用。3、蛋白酶K准备：取出蛋白酶K，室温解冻，涡旋混匀后备用。4、磁性微粒准备：将磁性微粒涡旋混匀，保证均一。实验操作步骤：将20μl蛋白酶K溶液加入2ml离心管的管底。依次加入100μl全血、200μl裂解液BL，用涡旋振荡器混合15sec(以下简称涡旋混匀)，56℃水浴20min。向步骤1裂解处理的样品中依次加入300μl结合液BI、25μl的磁性微粒（移取前必须充分涡旋混匀），涡旋混匀，室温静置5min。磁性分离5min，弃上清。从磁性分离器上取出离心管，加入400μl清洗液BW-I，涡旋混匀，磁性分离至上清澄清（期间上下颠倒数次，以清洗离心管管壁），弃上清；重复本步操作，以400μl清洗液BW-I重复清洗一次。从磁性分离器上取出离心管，加入400μl清洗液BW-II，涡旋混匀，磁性分离至上清澄清（期间上下颠倒数次，以清洗离心管管壁），弃上清（尽可能弃去所有的清洗液BW-II）。打开离心管盖，将其室温晾干5min。从磁性分离器上取下离心管，向管中加入100μl洗脱液ES，涡旋混匀，56℃水浴5min。将离心管置于磁性分离器上，磁性分离至上清澄清。将上清液（分离纯化得到的DNA溶液）转移到2ml离心管中，直接用于下游实验或于-20℃保存备用。B：PCR扩增液准备（1）每人份需做两个反应，取两个无菌PCR薄壁管，在PCR薄壁管管盖上依次标有M、WT。（2）将试剂从-20℃取出平衡至室温，瞬时离心。在标有M的管中加入29µl扩增液（M），在标有WT的管中加入29µl扩增液（WT）。（3）分别向以上M和WT各管中加入1µl反应液。将管盖盖紧后，涡旋混匀，瞬时离心待用。C：待检测DNA样本的配制在上述标有M、WT管中分别加入3µl待测基因组DNA，分别再加入17µlddH2O使终体积为50µl。将管盖盖紧后，涡旋混匀，瞬时离心。D：PCR扩增将PCR管放入PCR仪中，按如下程序扩增：50℃2min；95℃5min；94℃30sec、60℃30sec、65℃1min（26Cycles）；65℃10min；4℃Hold。取出PCR产物，2~8℃保存。E：检测卡检测实验从密封袋中取出检测卡，将待测样本M与WT管中的PCR产物分别滴加在检测卡对应的样品垫处，待2~5min对结果进行判读，20min后结果不可靠。F：质量控制（1）检测结果中阳性对照应在阳性对照卡检测线（T线）出条带，阴性对照应在阴性对照卡检测线（T线）不出条带。正常检测时，应定期进行阳性对照品及阴性对照品实验。（2）阳性对照品实验：取两个无菌PCR薄壁管，在PCR薄壁管管盖上依次标有M、WT，将20µlM阳性对照液、20µlWT阳性对照液分别加入标有M、WT的PCR薄壁管中，再依次分别加入M扩增液29µl及1µl反应液、WT扩增液29µl及1µl反应液，按照步骤中D~F完成，检测线（T线）及质控线（C线）均应出现条带。（3）阴性对照品实验：取两个无菌PCR薄壁管，在PCR薄壁管管盖上依次标有M、WT，将M扩增液29µl、1µl反应液及WT扩增液29µl、1µl反应液分别加入标有M、WT的PCR薄壁管中，再分别加入20µl阴性对照液，按照步骤中D~F完成，质控线（C线）应出现条带，检测线（T线）应无条带出现。G：结果判读（如下图、下表）如上图一所示，以阳性对照液为模板进行PCR反应，对PCR产物进行检测，检测线（T线）有条带出现，作为阳性对照；以阴性对照液为模板进行PCR反应，对PCR产物进行检测，检测线（T线）无条带出现，为阴性对照。若阴性样本有条带出现，有可能加样时未及时更换吸头，有DNA污染，建议在操作过程中，先配制阴性对照管并及时闭合PCR管盖。图二显示MTHFR677CC表示正常野生型；图三显示MTHFR677TT表示一对等位基因的第677位胞嘧啶（C）均变为胸腺嘧啶（T），即纯合突变；图四显示MTHFR677CT表示其中一个等位基因的第677位胞嘧啶（C）变为胸腺嘧啶（T），即杂合突变；图五质控线（C线）无条带或质控线（C线）与检测线（T线）均无条带，即为无效检测。无效原因可能为操作不正确或试纸条已变质损坏。应再次仔细阅读说明书，并用新的检测卡重新检测。如果问题仍然存在，应立即停止使用该批号产品，并与厂家或供应商联系。图二野生型图二野生型图三纯合突变图一阳性及阴性对照图五无效图图四杂合突变H：注意事项（1）实验室应该遵循PCR实验规范的要求分区操作，各区物品均为专用，不得交叉使用，加模板和引物的移液器不能混用，每次加样后均需更换吸头，推荐使用无核酶、带滤芯的吸头。各区的仪器、设备和工作服应独立使用。（2）本试剂盒用于体外操作。用户切勿吸入试剂或直接接触皮肤。（3）使用本试剂盒前，请仔细阅读说明书，严格按照说明书的要求操作。打开包装后请尽快使用。（4）使用本试剂盒时，因PCR体系为50µl体系，应使用200µl的PCR扩增管进行操作。（5）本试剂盒备有“PCR组分加入确认单”，在【检测方