郴州汝城地区猪瘟病毒检测方案设计

郴州汝城地区猪瘟病毒检测方案设计1前言自2018年我国发现非洲猪瘟后，我国生猪存栏量急剧下降，导致市场上的猪肉流通量减少，猪肉价格不断上涨。本人在实习期间对于非洲猪瘟有了一定了解，只要及时发现病毒并做出相应计划，这样就能很大程度上的减少非洲猪瘟病毒对猪场的影响。本设计主要以郴州汝城地区三星工业园的猪场为出发点，对其非洲猪瘟病毒的检测进行方案设计。2实验室设计3实验步骤对于非洲猪瘟，实验室常用的检测方法是荧光定量PCR检测法，该方法灵敏度高、耗时短、对样本的纯度要求低。但同时也会存在一些假阳性或假阴性等问题。3.1采样现如今，生物安全防控的措施虽然很大程度上控制了非洲猪瘟病毒的传播，但最关键的还是要早期确诊排查并清除感染猪。首先，我们可以对猪场的各个环节进行系统、全面的采样检测，通过病原检测来检查是否存在非洲猪瘟病毒核酸。例如，我们可以对通道、车辆、门口、人员、厨房、饲料、水源、死猪、病猪、猪群、栏舍、工具等进行采样。与猪相关的可以采取血样、唾液、组织、分泌物等，其余的则可以通过医用纱布或医用棉签来进行拭子采样。其次，采样时应注意防止人为污染，采样员需戴好PE手套，对于被采样对象也应该有着重点。例如，人员采样在头发、脸、鼻腔、牙齿、衣服袖口、手肘、裤脚、鞋底等着重采样。采样后，需立即将自封袋密封，以防环境污染样品或样品污染环境。人员进场流程（人员在进入猪场前需要执行以上六个流程后才可以进入）3.1.1前处理采样后，对样品进行分类、标记、编号并记录在表上，如果当天样品很多，可以将其两个样品进行合样后再进行检测，这里需要注意的是，允许合样的样品最多只能是两个，因为合样的样品过多，会影响检测结果准确性。不同的样本有不同的前处理，如下表：样品类型前处理方式核酸提取病料组织分样、研磨均匀200ul悬液全血/血浆/血清抗凝/促凝、分离上清200ul拭子浸泡、取上清200ul上清液唾液离心、除杂质200ul上清液精液液化、冻融、离心200ul上清液病毒培养物、疫苗一般直接用于提取200ul悬液饲料样本粉碎后浸泡15~30分钟200ul上清液前处理完后，取200ul上清液/悬液与20ul裂解液依次加入核酸提取试剂盒中，我们所采用的试剂盒提取核酸的方法为磁珠法。通过磁珠法我们可以从血液、动物组织、病原微生物等样本中分离出DNA和RNA。最后，将核酸提取试剂盒放入核酸提取仪按所设程序相应时间等待核酸提取完成即可。3.2配液从非洲猪瘟病毒实时荧光PCR快速检测试剂盒中取出荧光PCR反应液(PCRMIX)，融化后8000rpm离心10s。向设定的N个PCR反应管中分别加入15ulPCR反应液，再向已经加入PCR反应液的每管中加入处理后样品或阴性对照（NTC）和阳性对照（PTC）5ul，放入漩涡震荡仪中震荡5～10秒，再7000rpm瞬时离心5s。这里需要注意的是，阴性对照必须加在第一管第一个，这样能防止阴性对照被其他样品污染并且在一定程度上能对环境进行监测。阳性对照一定要加在最后一管最后一个，是为了防止阳性对照对其他孔位造成影响。PCR反应管的盖子是一定要严密盖紧的，以免造成阳性样本或样品泄露，从而引起重大污染。PCR反应管中不能有气泡，气泡会影响实验结果。漩涡震荡仪3.3扩增及结果分析将已经加入反应液和样品的pcr反应管放入荧光定量pcr检测仪。等待一定时间直到荧光定量PCR检测仪程序运行完毕，可直接读取结果，并根据噪声条件调整基线和阈值设置原则，使阈值线刚好高于正常阴性样品放大曲线的最高点。在实验成立的情况下，CT值小于等于35的样本为阳性，它的扩增曲线也呈现出明显扩增趋势，表明该核酸阳性；CT值大于40或显示为无的样品为阴性，表明核酸阴性；若CT值在35~40之间，则判为可疑样品。此类样品需要重新抽提核酸，进行荧光PCR检测。若重复扩增曲线为S型曲线，判为样本阳性，否则为阴性。（检测完后，将pcr反应管拿出，观察液面是否平齐，以此来判断实验过程中样液是否蒸发）（如图所示，精液包装盒样品末尾出现了明显的扩增曲线，且CT为35.01，在可疑范围，说明该样品需要复检。而复检后仍出现了明显扩增曲线，证明该样品可判断为阳性。）（如图所示，快递纱布的样品曲线接近直线上升，且不存在明显s型扩增曲线，所以并不能将它判定为阳性。出现这种曲线可能是因为：一、八连管密封性不好或未盖紧导致部分液体挥发。二、仪器在运行过程中升温加热管内液体时，有部分液体挥发至管壁或顶，导致液体的本体荧光物质浓度增加，导致其荧光信号加强。）3.4实验后处理实验完成后，要进行以下消毒：用酒精擦拭移液器用84消毒液将实验台面擦拭干净用核酸清除剂对瞬时离心机和核酸提取仪进行擦拭清理垃圾，紫外灯开半小时离心管板和镊子用84消毒液浸泡半小时，后用清水清洗干净、晾干4污染途径因为非洲猪瘟的原因，猪场的疫情防控措施和生物安全监测的好坏也就直接影响了猪场的存亡。非洲猪瘟病毒的传播途径在不同的场所过程都不一样，目前已知非洲猪瘟主要传播是通过接触了受非洲猪瘟病毒污染的物品；而被污染的饲料、水、栏舍、车辆、衣物、器具等也会间接传播该病毒。若猪场内部或外围人员去了菜市场这类密集场所（污染严重的地方），也有可能将病毒携带回来。5防控措施（1）应该严格控制人员、车辆进出，进出的人员、物品、车辆均要消毒。（2）所有人员不管进出还是休假在进入猪场前都需要隔离。（3）若发现死猪或病猪需及时送检并采取措施。（4）不从外面购买猪肉制品以减少感染风险。（5）减少外来人员入场。（6）控制车辆入场次数。6总结当实验结果显示阳性，即某区域、物品或人员为阳性，就可以思考目前所采取的生物安全措施是否合适；如消毒方式是否需要改进？物品所经途径是否污染性大、是否需要改变途径？人员是否去了易污染场所？生物安全监测并不是针对每一天，而是针对猪场的各个环节/途径的风险