DB15T 2506-2022羊捻转血矛线虫检疫鉴定方法

ICS65.020.30CCSICS65.020.30CCSB41内蒙古自治区地方标准DB15/T2506—2022羊捻转血矛线虫检疫鉴定方法Quarantineidentificationmethodofhaemonchuscontortusinsheep2022-01-252022-01-252022-02-25内蒙古自治区市场监督管理局发布前 言本文件按照GB/T1.1—2020《标准化工作导则第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定起草。本文件由内蒙古畜牧业标准化技术委员会（SAM/TC19）归口。羊捻转血矛线虫检疫鉴定方法范围本文件规定了羊感染捻转血矛线虫的诊断依据、检疫鉴定原则及鉴别诊断。本文件没有规范性引用文件。下列术语和定义适用于本文件。捻转血矛线虫haemonchuscontortus俗名：捻转胃虫，分类地位见附录A。捻转血矛线虫haemonchuscontortus俗名：捻转胃虫，分类地位见附录A。捻转血矛线虫感染haemonchuscontortusinfection可在宿主粪便中检出捻转血矛线虫虫卵或能在宿主真胃内检出捻转血矛线虫成虫，而宿主无明显临床症状和体征。捻转血矛线虫病haemonchosiscontortus4诊断依据流行病学宿主生活或来源于捻转血矛线虫病流行区，且有采食被捻转血矛线虫感染性幼虫污染的青草或饲料史。4.2.1急性型羊只显著贫血，眼睑黏膜苍白，身体逐渐衰弱、消瘦，被毛粗乱，下痢和便秘交替，严重时下颌、下腹部及四肢水肿，短期内引起羔羊死亡。4.2.2慢性型羊只被毛粗乱而无光泽、动作迟钝、体形消瘦、发育受阻、生长停滞。实验室检查GC。G。DNAPCRGG。4.3.14.3.2、4.3.34.3.44.3.5诊断疑似捻转血矛线虫感染疑似捻转血矛线虫感染无明显临床症状，同时符合4.1和4.2，且符合4.3.1、4.3.2、4.3.3中任两条。确诊捻转血矛线虫感染疑似捻转血矛线虫感染，且符合4.3.4和4.3.5中的任一条。7鉴别诊断捻转血矛线虫卵与其他胃肠道线虫卵相鉴别见附录F。。附录A（资料性）捻转血矛线虫分类地位血矛线虫属线虫的系统发育树（HobergEP等,2004）见图A.1。捻转血矛线虫（Haemonchuscontortus）属于动物界（Animalia），线虫纲（Nematoda），圆线目（Strongylida），毛圆科（Trichostrongylidae），血矛属（Haemonchus）。该属共有12种虫体（图1），其中，捻转血矛线虫为该属发现的第一种虫体。****图A.1血矛线虫属线虫的系统发育树（HobergEP等,2004）附录B（资料性）捻转血矛线虫生活史捻转血矛线虫生活史见图B.1。捻转血矛线虫整个生活史包括自由生活期和寄生生活期。按照虫卵孵化后的发育结构可划分为五27℃条件下经518图B.1捻转血矛线虫生活史附录C（资料性）捻转血矛线虫虫卵形态粪便中检出的捻转血矛线虫虫卵（40×）见图C.1。70.9μm×45.9μm，65.5μm×43.3μm95.0μm×46.6μm1.0μm图C.1粪便中检出的捻转血矛线虫虫卵（40×）粪便中检出的捻转血矛线虫虫卵（400×）见图C.2。图C.2粪便中检出的捻转血矛线虫虫卵（400×）附录D（资料性）捻转血矛线虫感染性三期幼虫形态捻转血矛线虫感染性三期幼虫形态（40×）见图D.1。0.65～0.75mm×0.025～0.030mm160.054mm～0.068mm。图D.1捻转血矛线虫感染性三期幼虫形态（40×）附录E（资料性）捻转血矛线虫成虫形态捻转血矛线虫形态结构见图E.1。1.8cm～3.01.5cm～2.2cmY”A胃黏膜上的捻转血矛线虫虫 B胃黏膜上量的捻转血矛线虫C捻转血矛线虫成虫头部（100×）C捻转血矛线虫成虫头部（100×）D捻转血矛线虫雌虫尾部（100×）E捻转血矛线虫雌虫阴门盖（100×）F捻转血矛线虫雄虫交合刺（400×）图E.1捻转血矛线虫形态结构附录F（F.1。表F.1羊粪便中常见胃肠道线虫虫卵特征虫种名称虫卵图谱形态描述长径(μm)辐径(μm)捻转血矛线虫Hcemonchuscontortus虫卵椭圆形，卵壳略带黄色。66～9543～46环纹奥斯特线虫Ostertagiacircumcincta虫卵椭圆形，系典型的圆线虫类虫卵。89～9546～59叶氏古柏线虫Cooperiaerschovi虫卵椭圆形。67～7322～41蛇形毛圆线虫Trichostrongyluscolubriformis虫卵椭圆形。73～7640～43羊仰口线虫Bunostomumtrigonocephalum虫卵两端钝圆，两侧平直，胚细胞大而数少，内含暗色颗粒。82～9747～57哥伦比亚食道口线虫Oesophagostomumcolumbianum虫卵椭圆形，刚排除时内含卵裂细胞8～16个。65～7540～45表F.1羊粪便中常见胃肠道线虫虫卵特征（续）虫种名称虫卵图谱形态描述长径(μm)辐径(μm)绵羊夏伯特线虫Chabertiaovina虫卵椭圆形。85～13042～56F.1。图F.1捻转血矛线虫感染性幼虫与羊其他圆线虫的感染性幼虫图F.1捻转血矛线虫感染性幼虫与羊其他圆线虫的感染性幼虫附录G（规范性）实验室检查原理40取400g食用盐溶于1000mL烧开的纯净水中，充分搅拌，待冷却后使用。取新鲜粪便样品2g于50mL烧杯中，加少许饱和食盐水用镊子压碎，加饱和食盐水至20mL，搅拌均匀，用40目筛网过滤，将滤液置于安剖瓶中，使液面略高于瓶口，静置30min。15mL287r/min5min。将离心管取出，弃上清，吸取沉淀于载玻片上，在普通光学显微镜下观察、鉴定。PCRPCRDNA50×TAEDNAMarker2000PCRMix、DNADNADNADNA以所提的DNA样本为模版，使用捻转血矛线虫特异性引物HAE（5’-CAAATGGCATTTGTCTTTTAG-3’）/NC2（5’-TTAGTTTCTTTTCCTCCGCT-3’）进行PCR扩增。PCR反应体系为：25μL体系中加入上下游引物（10mmol/L）各1μL，2×PCRMix12.5μL，DNA模版2μL，无菌无酶水8.5μL。PCR扩增条件为：94℃预变性5min；94℃变性30s；55℃退火30s；72℃延伸30s；35个循环；72℃总延伸7min；4℃保存。对扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，以阳性对照组和待检样本扩增出265bp的目标条带，阴性对照组未扩增出条带，判定为捻转血矛线虫感染阳性；阳性样本进一步测序，序列与标准序列一致。捻转血矛线虫标准序列：caaatggcatttgtcttttagacaattcccatttcagttc aagaacatat acatgcaacg aaattgtaacattcctgaatgatatgaacatgttgccactatttgagtgtactcagcgaatattgagatt gacttagata gtgacttgta gttcttttatcatttgtataatgcaacctgagctcaggcgtgattacccgctgaacttaa