蛋白质放射性碘化标记实验

蛋白质放射性碘化标记实验【目的】掌握最常用的氯胺-T法碘化蛋白的要领学会用柱分离纯化碘化蛋白的方法学会标记率、比放射性、放射性化学纯度的计算【原理】蛋白质碘化是利用蛋白质分子上的酪氨酸残基和碘正离子的置换反应，Na125I125I在氧化剂（氯胺-TIodogen、过氧化物酶等）作用下，被氧化成125I2，将酪氨酸残基中酚基邻位氢置换下来，即获得碘化的蛋白质。氯胺-TN-它在水中产生次氯酸，是一温和的氧化剂。

Na-SO2NCl1616′·16″··116···············22′2″11A1′B1″C11222【试剂与器材】1、试剂：

3.放射纸层析图（单位：cm）1%BSA（pH7.5 0.05MPD配制）0.4ml10%三氯乙酸（TCA）10ml74KBq/50μl Na50μl50μg/50μl BSA(pH7.5，0.5MPB配制)50μl氯胺T、偏重亚硫酸钠各10mg临用前1mlpH7.5,0.5MPB溶解10%KI 250μl0.5MPBpH7.5 50μlMPBpH7.5 100ml葡聚糖凝胶 SephadexG-50 50~101%NaI20ml2、器材：1ml玻璃移液管2支尖头滴管2支一次性塑料试管80支10μl微量注射器2支200μl微量加样器2支200μl微量加样器头10个青霉素小瓶（带塞）1个（1小磁棒）分离柱（1×20cm）1个电磁搅拌器1台18×6cm滤纸（WhatmanI或新华1号）1条1所示做好标记，A、B、C5μl1%NaI稍微吹干。层析缸1个 吹风机1个剪子1把 镊子1把 γ计数仪1台4Sephadex柱层析图【操作步骤】SephadexG-50柱的制备：SephadexG-505~10g,50ml蒸馏水泡过夜或沸水浴中煮40′，倾去上清，沉淀加入pH7.5,0.05MPB50ml混匀使成悬液，装入清洁的层析柱，如图2所示，使SephadexG-50均匀沉积20多余的吸出勿使柱干掉加0.4 ml1%BSA饱和柱以减少Sephadex对125I-蛋白质的物理吸附，提高过柱后125I-蛋白质的利用率。在1%BSA通过的同时，用1%TCA检查BSA流出柱的情况，以供收集15-蛋白峰作参考。1、取装有磁棒的青霉素小瓶1个，在电磁搅拌机上依次加入下列试剂50ug/50ul BSA 50ul74KBq/50μl Na125I 50μ10mg/ml氯胺-T 50μl电磁搅拌下反应2′10mg/ml偏重亚硫酸钠100ul终止反应10%KI 250μl500μl5μlA5μl125I的总量。1%BSASephadexG-50250μl10%溶液洗反应瓶，追加上柱，待全部反应液完全进柱后，开pH7.0.05MPB1010（0.5ml，125I-BSA或与标记蛋白无关的动物血清饱和，如冻干马血清。放射性测量：依次测定各收集管的放射性计数，以计数率为纵坐标，管125I-BSA125I5μlB者存冰箱待用。另取约5μlNa125I滴于滤纸C处，冷风吹干。10%TCA30%。将滤纸在各划线处剪开，所得各纸条分别置于试管中，测量其计数率。【结果计算】利用装有样品纸条各管所得计数率cpm进行计算标记率

蛋白峰放射性原点A计数率加入总放射性

100%A纸条放射性化