免疫学实验技术概述课件

第九章免疫学实验技术概述血清学反应：体外发生的抗原抗体反应。第一节体液免疫的检测——血清学反应所有血清学反应类型的基本原理都万变不离其宗：抗原抗体反应的特异性。二、血清学反应的一般规律(一)特异性Ab只能与相应Ag特异结合。Ag表面常具有多个(多种)不同表位，所以免疫血清中也应含有相应多种特异性Ab。（二）交叉性交叉抗原：不同的Ag物质之间存在相同的Ag表位时，称为交叉抗原。交叉反应：用不同抗原制备的抗血清除与各自的相应Ag发生反应外，尚能与对方Ag发生反应。通常两种Ag之间亲缘关系越近，交叉反应程度越高。AB抗原与抗体的结合的交叉性(三)用已知测未知所有血清学反应都毫无例外地是用已知Ag测未知Ab或用已知Ab测未知Ag。用已知测未知的依据：抗原抗体的反应是特异的。正确理解实验原理或进行试验设计的关键是搞清楚什么是已知，什么是未知，谁是抗原身份，谁是抗体身份，谁是身兼两职的。IBV包被鸡抗NP蛋白IgG加IBV或被检加兔抗IBVIgG加羊抗兔IgG-HRP加底物显色夹心ELISA竞争ELISA3．氢链此力由两个共价结合的氢原子间发生，H原子与一个带负电荷的原子共价结合，与另一个带负电荷的非共价电子对相互作用，形成了氢链。

此力较弱，但较特异，此外还有疏水作用(如苯环具有疏水性)。总之Ag-Ab结合不仅要求结构上互补，构型上适应，电荷上相反，方能结合，结合后，由亲水胶体→憎胶体，此时如果Ag·Ab复合物电荷相同，则同性相斥，仍分散于溶媒中，如果有适当浓度电介质存在，可消除电荷，从而促进其凝集或沉淀。任何抗血清中均含高亲合力Ab和低亲合力Ab，上述亲合力在生理性pH离子强度中通常最大。

Ag-Ab结合的离解力，指Ag-Ab结合具有可逆性，因为Ag-Ab之间靠非共价结合，因此在一定条件下可使其解离。解离后的Ag-Ab仍保留其原有活性。

(六)结合比例

Ag与Ab的结合常需适当比例才出现可见反应，在最适比例时反应最明显；这种现象可以用“格子学说”来解释：Ab(1gG)为二价，Ag通常为多价，只有Ag，Ab结合形成大的复合物，肉眼才可见；(七)血清学反应的影响因素1．电介质：生理盐水，缓冲盐水，少数动物(禽)血清用8.5％NaCl；2．温度；3．pH：pH6.0～8.0四、血清学试验的制定原则制定特定的或建立新的血清学方法时，应注意以下原则：(一)Ag准备和提纯1．购自试剂公司：如半Ag、激素、酶、农药、抗生素、昂贵的天然Ag等。2．自制：一般天然Ag、动物血清、组织Ag等，(二)Ab制备提纯1．颗粒性Ag，递增3～4次、间隔一周可溶性Ag，加佐剂2．提纯：用作标准、致敏或特殊用途(七)敏感性试验最小检测量或最小反应灵敏度(八)重复性试验：该试验是结果可信度和试验标准化程度的重要指标之一。每批材料对每份样品至少做四个重复。计算批内变异系数。不同批的材料，应对同样样本进行复试，计算批间变异系数。(九)稳定性试验提供商品试剂盒所必须五、血清学试验的应用(一)血清学诊断(二)生物活性物质超微定量(三)Ag/Ab亚细胞、细胞水平定位(四)Ag组分分析，如病毒结构蛋白可用免疫转印，免疫沉淀(琼扩、电泳、交叉免疫电泳等)(五)物种鉴定分型

六、血清学试验的类型（一）沉淀反应：环状沉淀试验双向琼脂扩散免疫电泳原理：

可溶性Ag与Ab在含有电解质的半固体（1%）琼脂内进行自由扩散，当两者由高浓度向低浓度扩散相遇时，如果二者相对应而且比例适当，则可在相遇处形成白色的沉淀线，为阳性反应。另外，沉淀带对于组成它的Ag、Ab具有特异地不可透过性，而对其它的Ag与Ab是可透过的，所以一条沉淀带仅代表一种AgAb系统的沉淀物。双向琼脂扩散试验（二）凝集反应：原理：颗粒性抗原（如细菌、立克次氏体、螺旋体、红细胞或细胞悬液）或表面覆盖抗原或抗体的颗粒状物质，与相应抗体或抗原结合后，在有电解质存在时，抗原（颗粒）互相凝集成肉眼可见的凝集小块，称为凝集反应。直接凝集：平板、试管间接凝集：间接血凝、炭凝、乳胶凝集病毒的血凝和血凝抑制试验玻片凝集试验血凝和血凝抑制试验Hemagglutination(HA)andHemagglutinationInhibition(HI)原理许多病毒（正粘病毒、副粘病毒等）能凝集某些动物（鸡、人等）的红细胞，这种现象称为红细胞凝集现象，简称血凝。当这些病毒与相应的抗体发生特异性结合后，失去了与红细胞凝集的能力，称为红细胞凝集抑制。血凝和血凝抑制试验Hemagglutination(HA)andHemagglutinationInhibition(HI)HIHA弃501．做标记；2．加生理盐水；3.第1孔加NDV，然后倍比稀释；4．加红细胞；5．立即振荡2min，静置20－30min；6.观察结果。++++为全部血球发生凝集，呈颗粒状薄膜铺于孔底；

+++约有75％血球发生凝集；

+约有25％血球发生凝集；

++约有50％血球发生凝集；－不凝集，表现为血球沉于孔底，呈一致密小圆点，与对照孔相同。（一）血凝试验（HA）（二）血凝抑制试验（HI）弃50µL1．做标记；2.第1孔加8U抗原和被检血清；3.从第1孔取样50µL，然后倍比稀释；4.室温静置10min；5．加红细胞,立即振荡2min，静置20－30min;6.观察结果。结果记录中的-、+、++、+++、++++和HA中的相同

（三）补体结合反应技术

（complementfixationreactiontechnique）（四）标记技术：同位素标记荧光标记：化学发光免疫技术酶标记：组化法、测定法（ELISA）胶体金标记技术酶联免疫吸附试验酶联免疫吸附试验（EnzymeLinkedImmunoSorbentAssay），简称ELISA。原理：简单地说是利用抗原-抗体反应的高度特异性和酶反应的高度敏感性，进行对抗原或抗体的检测，是一种定性或定量的综合性技术。IBV包被鸡抗NP蛋白IgG加IBV或被检加兔抗IBVIgG加羊抗兔IgG-HRP加底物显色夹心ELISA夹心ELISA间接ELISA竞争ELISA

20世纪80-90年代在酶联免疫吸附试验、乳胶凝集试验、单克隆抗体技术、胶体金免疫技术和新材料技术基础上发展了新型体外诊断技术。具有简单、快速、成本低、可通过肉眼判定结果、无需特殊设备、携带方便等和无污染等优点，有浓缩的ELISA之称，。胶体金免疫层析技术90年代传入我国以来，在医学方面得到了日益广泛的应用。已经用于检测HBsAg（乙肝）、HCG（早孕）、HIV（艾滋病）、梅毒等疾病的快速诊断，我国已经有几十家药厂生产医学检验用的金标试纸。目前，该项技术已被应用于动物疫病的检测与药物残留分析等。

胶体金（colloidalgold）也称金溶胶（goldsol），是金盐被还原成原子金后形成的金颗粒悬液。HAuCl4溶液还原剂胶体金胶体金

胶体金颗粒对蛋白质有很强的吸附功能，而不被坏其生物活性，可以与葡萄球菌A蛋白、免疫球蛋白、毒素、糖蛋白、酶、抗生素、激素、牛血清白蛋白等非共价结合，形成胶体金标记物。用于免疫测定时胶体金多与免疫活性物质（抗原或抗体）结合，这类胶体金结合物常称为免疫金复合物，或简称免疫金（immunogold）。

类别应用领域检测的物质人类医学各级医院,血站,CDC,防疫站,诊断中心；家庭自检；商检系统；边检口岸；公安系统.传染病（乙肝五项,HIV,SARS等）标志物（AFP、肌钙蛋白、粪便血红蛋白等）女性妊娠hCG(早孕)毒品（吗啡,K粉,摇头丸,冰毒）农牧业畜牧兽医站,商检系统,边检口岸,农牧类院系和研究所传染病（禽流感,链球菌等）病毒（烟草花叶病毒、犬细小病毒等）环境环保监测部门,研究机构有害物质超标食品安全食品安全检测中心,各监管部门农兽药残留（磺胺类、瘦肉精等）,大肠杆菌,黄曲霉素应用

目前，胶体金免疫层析法在兽医学方面的应用也越来越广泛，主要在通过抗原及抗体的检测由于疾病的诊断，如鸡传染性法氏囊病（于海等，2004；张改平等，2004）、鸡新城疫（高玲美等，2004；戴荣四等，2006；李希友等，2006）、禽流感（沈浩龙等，2006；蔡家利等，2006）、鸡减蛋综合征（王爱华等，2005）、鸽禽Ⅰ型副黏病毒病（郝桂兰等，2005）、猪圆环病毒（金颜辉等，2007）、猪瘟（金颜辉等，2004；郑鸣等，2006）、伪狂犬病（黄印尧等，2004；边传周等，2006）、猪繁殖与呼吸综合征（崔尚金等，2005）、口蹄疫（张长弓等，2004）、猪囊虫病（唐雨德等，2003）、猪旋毛虫(Zhangetal.，2006）、犬细小病毒病（王中力等，2004）、牛布鲁氏菌病（唐景峰等，2007；洪林娣等2007）、牛病毒性腹泻病毒（Kameyamaetal.，2006）、羊布鲁氏菌病（唐景峰等，2006）、沙门氏菌（Kun-HoSeoetal.，2003；陈琼等，2006）、大肠杆菌（谌志强等，2005；王静等，2006）、利什曼原虫（Robertoetal.，2003；Mohebalietal.，2004）、炭疽杆菌芽孢（李伟等，2004）；以及用于牛初乳中IgG含量（刘春龙等，2006；李忠秋等，2006）。夹心法反应原理（检测抗原）C阴性B阳性GICA有三种反应模式：夹心法，间接法，竞争抑制法。H9亚型AIV抗原检测试纸条ThereferenceH9AIVtiterwas26andthe