chapter4细胞破碎课件

Chapter4CellDisruption

第四章细胞破碎※

4.0Summary概述细胞破碎的目的细胞破碎的原因由于有许多生物代谢产物存在于细胞内部，必须在纯化以前将细胞破碎，使胞内物质释放到液相中，然后方可进行提取尤其是由基因工程菌产生的大多数蛋白质不会被分泌到发酵液中，而是在细胞内沉积。脂类物质和一些抗生素也是包含在生物体中。破碎细胞的目的就是破坏细胞壁和细胞膜，增加其通透性，尽可能释放胞内的目标产物。细胞破碎多用于小规模生产，在大规模生产中应用极少。4.1细胞壁细胞壁：细胞膜强度差，易破碎，细胞壁坚韧，是主要的破碎阻力，植物细胞和微生物细胞具有细胞壁，破碎难度大，动物细胞没有细胞壁，破碎难度小。不同微生物细胞壁具有不同的特性生物类型G+细菌G-细菌酵母菌霉菌植物细胞主要组成肽聚糖（40-90%）多糖胞壁酸蛋白质脂多糖（1-4%）肽聚糖（5-10%）脂蛋白脂多糖（11-22%）磷脂蛋白质葡聚糖（30-40%）甘露聚糖（30%）蛋白质（6-8%）脂类（8.5-13.5%）多聚糖（几丁质）（80-90%）脂类蛋白质初生壁次生壁微生物细胞壁：细菌：革兰氏阳性菌：肽聚糖层厚，难破碎革兰氏阴性菌：肽聚糖层外还具有脂多糖，磷脂，脂蛋白，容易破碎革兰氏阴性菌革兰氏阳性菌方法技术原理效果成本举例化学法渗透冲击渗透压破坏细胞温和便宜血红细胞的破坏酶消化法细胞壁被消化，使细胞破碎温和高酶解酵母增溶法表面活性剂溶解细胞壁温和适中胆盐作用于大肠杆菌脂溶法有机溶剂溶解细胞壁并使之失稳适中便宜甲苯破碎酵母细胞碱处理法碱的皂化作用使细胞壁融解剧烈便宜表4.0-1.细胞化学破碎法4.2化学破碎法利用溶解细胞壁的酶处理菌体细胞，使细胞壁受到部分或完全破坏后，再利用渗透压冲击等方法破坏细胞膜，进一步增大胞内产物的通透性。利用溶酶系统处理细胞时必须根据细胞壁的结构和化学组成选择适当的酶，并确定相应的次序。1.酶消化法破碎细胞中常用的酶常用的溶酶溶菌酶β-1，3-葡聚糖酶β-1，6-葡聚糖酶蛋白酶甘露糖酶糖苷酶肽键内切酶壳多糖酶酶消化法的优点：选择性释放产物，条件温和，核酸泄出量少，细胞外形完整。酶消化法的缺点：酶价格高，该法通用性差，产物抑制的存在。酶法广泛应用于酵母细胞的水解,获取酵母抽提物作为调味品或获取核酸用于制备核苷酸植物细胞的水解,水解纤维素获取葡萄糖碱处理法和酶消化法相反，反应激烈，不具选择性，但成本低廉。碱加入细胞悬浮液中后和细胞壁进行了多种反应，包括使磷脂皂化，使细胞壁的成分溶于表面活性剂，也使蛋白质变性。该法不仅破坏了细胞壁也破坏了产物。该法多用于细胞破碎获取粗提物2.碱处理法三种主要细胞破碎化学方法中最简单的是渗透冲击法。此法将一定体积的细胞液加到2倍体积的水中，细胞中溶质浓度高，水不断进入细胞，使细胞膨胀，最后导致破裂。3.渗透冲击法将细胞放在高渗透压的介质中（如一定浓度的甘油或蔗糖溶液），达平衡后，转入到渗透压低的缓冲液或纯水中，由于渗透压的突然变化，水迅速进入细胞内，引起细胞溶胀，甚至破裂。仅适用于细胞壁较脆弱的细胞或细胞壁预先用酶处理或在培养过程中加入某些抑制剂（如抗生素等），使细胞壁有缺陷，强度减弱。

渗透流的动力来自渗透压，渗透压可能很大。可以通过化学平衡来估算，水的化学电势是常数，即：µH2O(外)=µH2O(内)(4.2-1)细胞外纯水的化学电势包括标准化学电势和压力修正项；与之平衡的胞内的化学电势包括三项，即标准化学电势、压力修正相和浓度修正项。对于理想的不可压缩溶液，这些修正相和式（4.2-1）可改写为：

µθH2O+VH2OP外=µθH2O+VH2OP内+RTln(1-x1)(4.2-2)µθH2O——标准化学电势VH2O——水的偏摩尔体积x1——细胞内所有溶质的总摩尔分数若胞内物为稀溶液，其偏摩尔体积等于纯水的摩尔体积。且x1很小时：Pout-Pin=(RT/--VH2o)×ln(1-x1)=(RT/--VH2o)×(-x1-x2/2-x3/3)=-RTc1+…(4.3)该式称为范特霍夫定律。由该方程知细胞内压力必须小于细胞外压力，否者，水会流入细胞内，溶破细胞。可以采用等式4.3估算出渗透压的大小。许多细胞内溶质浓度大约相当于0.1M或0.2MNaCl。由此可见渗透压必须很大，才能导致细胞的破碎4、增溶法

该法是利用表面活性剂。最典型的是将体积为细胞体积两倍的某浓度的表面活性剂加入到细胞中。表面活性剂能将细胞壁破碎，制成的悬浮液可用离心分离除去细胞碎片，再用吸附柱或萃取剂分离制得产品。该法关键在于表面活性剂的化学性质，由图4.2-1所示的化学结构表示。结构中有一个亲水基团，通常是离子；一个疏水基团，通常是烃基。牛磺胆酸钠：溶解脂肪十二烷基磺酸钠：增加脂类的亲水性表面活性剂可促使细胞某些组分溶解，其增溶作用有助于细胞的破碎。无论表面活性剂是阴离子、阳离子还是非离子型，都是两性的。SDS（十二烷基磺酸钠）是典型的阴离子表面活性剂。阴离子表面活性剂还包括肥皂（脂肪酸盐）。阳离子表面活性剂主要是烷基胺盐。图4.2-1中的十二烷基溴胺是典型的例子。它有一个长烷烃链（十六烷基）和三个甲基，都连接在一个带正电的氮原子上，负离子通常是卤素。细胞破碎时条件较温和。

4.3物理破碎法物理破碎法主要是利用高压、研磨或超声波等手段在细胞壁上产生的剪切力达到破碎目的.包括高压匀浆法,珠磨法和超声破碎法方法技术原理效果成本举例机械法匀浆法（片型）细胞被搅拌器劈碎适中适中动物组织及动物细胞研磨法细胞被研磨物磨碎适中便宜超声波法用超声波的空穴作用使细胞破碎适中昂贵细胞悬浮液小规模处理匀浆法（孔型）须使细胞通过的小孔，使细胞受到剪切力而破碎剧烈适中细胞悬浮液大规模处理珠磨破碎法细胞被玻璃珠或铁珠捣碎剧烈便宜细胞悬浮液和植物细胞的大规模处理表4.0-1.细胞物理破碎法1.高压匀浆法（High-pressurehomogenization）利用高压使细胞悬浮液通过针形阀，由于突然减压和高速冲击撞击环使细胞破碎，细胞悬浮液自高压室针形阀喷出时，每秒速度高达几百米，高速喷出的浆液又射到静止的撞击环上，被迫改变方向从出口管流出。细胞在这一系列高速运动过程中经历了剪切、碰撞及由高压到常压的变化，从而造成细胞破碎。原理：——大规模细胞破碎的常用方法，在微生物细胞和植物细胞的大规模处理中常采用

Time,minFumaraseActivityAlcoholDehydrogenaseAdtivityApparentParticleSize图4.3-1匀浆破碎细胞过程高压匀浆器的排出阀易造成堵塞的团状或丝状真菌较小的革兰氏阳性菌含有包含体的基因工程菌不宜采用高压匀浆法的细胞类型。影响匀浆破碎的主要因素：压力、温度、通过匀浆器阀的次数JJ-2组织捣碎匀浆机

大、中、小型高压匀浆器细胞的匀浆破碎过程可用下述一级反应方程式来描述：Ct/Cm＝1－e－t/ŧCt－破碎细胞经t时间后的产物浓度，mol/LCm－破碎细胞经可达的最高产物浓度，mol/Lŧ－细胞破碎的时间常数，随剪切强度和压力而改变，min进入珠磨机的细胞悬浮液与极细的玻璃小珠、石英砂、氧化铝等研磨剂（直径小于1mm）一起快速搅拌或研磨，研磨剂、珠子与细胞之间的互相剪切、碰撞，使细胞破碎，释放出内含物。在珠液分离器的协助下，珠子被滞留在破碎室内，浆液流出从而实现连续操作。破碎中产生的热量一般采用夹套冷却的方式带走。2.珠磨法（Beadmill）原理：实验室规模的细胞破碎设备有Mickle高速组织捣碎机、Braun匀浆器；中试规模的细胞破碎可采用胶体磨处理；在工业规模中，可采用高速珠磨机（瑞士WAB公司和德国西门子机械公司制造）。珠磨法的破碎率一般控制在80%以下。珠磨法适用于细胞悬浮液和植物细胞的大规模处理。在珠磨法中，细胞的破碎率也能用一级速率方程式表示：ln[1/(1-R)]=KtK－破碎速率常数t－停留时间R－破碎率破碎速率常数K与许多操作参数有关，如搅拌转速、料液的循环流速、细胞悬浮液的浓度、玻璃小珠的装置和珠体的直径以及温度等。高速珠磨机(highspcedbeadmill)研磨是常用的一种方法，它将细胞悬浮液与玻璃小珠、石英砂或氧化铝等研磨剂一起快速搅拌，使细胞获得破碎。在工业规模的破碎中常采用高速珠磨机胶体磨德国进口珠磨机ZM系列卧式密闭珠(砂)磨机

利用发射15-25kHz的超声波探头处理细胞悬浮液。一般认为超声波破碎的机理是：在超声波作用下液体发生空化作用，空穴的形成、增大和闭合产生极大的冲击波和剪切力，使细胞破碎。3.超声破碎法（Ultrasonication）影响超声波的细胞破碎效率因素：频率、液体温度和粘度、处理时间等。超声波破碎法是很强烈的破碎方法，适用于多数微生物的破碎。一般杆菌比球菌易破碎，G-细菌比G+细菌易破碎，对酵母菌的效果较差。该法在实验室小规模细胞破碎中常用。超声波处理细胞悬浮液时，破碎作用受许多因素的影响，通常声强和振幅影响很大，但强度太高易使蛋白质变性，频率的变化影响不明显：此外介质的离子强度、pH值、菌体的种类和浓度也有很大的影响.超声波振荡过程中遇到的最大问题就是产生的热量不容易驱散，所以影响了它在大规模工业上的应用，但在实验室和小规模生产中是一种很好的方法4.4其他破碎方法冻结－融化法干燥法自溶法X-press法将细胞放在低温下突然冷冻而在室温下缓慢融化，反复多次而达到破壁作用。一方面使细胞膜的疏水键结构破裂，另一方面胞内水结晶，使细胞内外溶液浓度变化，引起细胞膨胀而破裂。适用于细胞壁较脆弱的菌体，破碎率较低，需反复多次。

1.反复冻结-融化法此法使细胞结合水分丧失，从而改变细胞的渗透性。气流干燥主要适用于酵母菌，一般在25-30℃的气流中吹干；真空干燥多用于细菌。

2.干燥法气流干燥真空干燥喷雾干燥冷冻干燥诱发微生物产生过剩的溶胞酶或激发自身溶胞酶的活力，以达到细胞自溶的目的。影响自溶过程的主要因素有温度、时间、