酶联免疫吸附试验(ELISA)课件

酶联免疫吸附试验(ELISA)测定方法ELISA概述ELISA基本原理ELISA试剂的组成ELISA测定方法ELISA实验过程ELISA在食品检测中的应用ELISA在国外研究进展ELISA概述enzyme-linkedimmunosorbentassay，ELISAELISA属于标记免疫学技术的一种，1971年由荷兰和瑞典的学者提出，由于其操作过程简单易行并可以定量，从而使其在食品安全和卫生检测中得到了广泛的应用。目前市场上有多种基于ELISA方法开发的用于食品中抗生素检测的试剂盒产品。ELISA基本原理使抗原或抗体结合到某种固相载体表面，并保持其免疫活性（固相抗原／抗体的形成）在测定时，把受检标本（测定其中的抗体或抗原）和酶标抗原或抗体按不同的步骤与固相载体表面的抗原或抗体起反应（抗原抗体反应）用洗涤的方法使固相载体上形成的抗原抗体复合物与干扰物质分开，最后结合在固相载体上的酶量与标本中受检物质的量成一定的比例。（酶标抗原抗体复合物的分离）

加入底物后，底物被酶催化变为有色产物，产物的量与标本中受检物质的量直接相关，故可根据颜色反应的深浅进行定性或定量分析。（显色反应）ELISA基本原理图示洗涤的方法将固相载体上的复合物与其他物质分离

将抗原或抗体固定于合适的载体上，并保持其生物活性

使抗原或抗体与某种酶连接，形成酶标抗原或抗体加入酶反应底物，复合物上的酶催化底物使其分解，氧化或还原成有色产物

待测样品与酶标抗原或抗体反应ELISA试剂组成完整的ELISA试剂盒应包含以下各组分：

（1）已包被抗原或抗体的固相载体（免疫吸附剂，俗称酶标板）

（2）酶标记的抗原或抗体（酶标记物）（3）酶的底物（4）系列参考标准品（定量测定）

（5）酶标记物及样本的稀释液

（6）洗涤液

（7）反应终止液2.免疫吸附剂 已包被抗原或抗体的固相载体，是ELISA方法中的核心试剂。4.酶的底物HRP的底物

常用的供氢体有邻苯二胺(OPD)和四甲基联苯胺(TMB)。

OPD氧化后的产物呈橙红色，用酸终止酶反应后，在492nm处有最高吸收峰，灵敏度高。

OPD见光易变质，与过氧化氢混合成底物应用液后更不稳定，须现配置现用。先进的ELISA试剂盒中则直接配成含保护剂的工作浓度为0.02%H2O2的应用液,只需加入OPD后即可作为底物应用。6.酶反应终止液

常用的HRP反应终止液为硫酸，其浓度按加量及比色液的最终体积而异，在板式ELISA中一般采用2mol/L。7.参考标准品

定量测定的ELISA试剂盒应含有制作标准曲线用的参考标准品，应包括覆盖可检测范围的4-5个浓度，一般均配入含蛋白保护剂及防腐剂的缓冲液中。

ELISA测定方法ELISA常用测定方法主要直接法和间接法。直接法是酶标记抗体与待检测样本中固相抗原直接作用，加入底物后，显色，其颜色深浅与样本中抗原量成正比；间接法是使已知抗原吸附在固相载体上，与待检测样本中的抗体作用，加入酶底物，显色，颜色深浅与样本中抗体量成正比。ELISA大致分为三类：（1）测定抗体的间接法。（2）测定抗原的双抗体夹心法。（3）测定抗原的竞争法。

前两种方法主要用于测定抗体和大分子抗原，适用于临床诊断上，而竞争法事测定小分子抗原的方法，因而尤其适用于食品分析。ELIZA方法图示间接法双抗体夹心法非竞争结合反应常用于抗原的检测适用于分子中具有至少两个抗原决定簇的多价抗原，而不能用于小分子半抗原的检测所用两种抗体分别针对同一个抗原分子的不同抗原决定簇SandwichELISAAless-commonvariantofthistechnique,called"sandwich"ELISA,isusedtodetectsampleantigen.Thestepsareasfollows:Prepareasurfacetowhichaknownquantityofcaptureantibodyisbound.Blockanynonspecificbindingsitesonthesurface.Applytheantigen-containingsampletotheplate.Washtheplate,sothatunboundantigenisremoved.Applyenzymelinkedprimaryantibodiesasdetectionantibodieswhichalsobindspecificallytotheantigen.Washtheplate,sothattheunboundantibody-enzymeconjugatesareremoved.Applyachemicalwhichisconvertedbytheenzymeintoacolororfluorescentorelectrochemicalsignal.Measuretheabsorbencyorfluorescenceorelectrochemicalsignal(e.g.,current)oftheplatewellstodeterminethepresenceandquantityofantigen.AsandwichELISA.(1)Plateiscoatedwithacaptureantibody;(2)sampleisadded,andanyantigenpresentbindstocaptureantibody;(3)enzymelinkedcaptureantibodyusedasdetectingantibodyisadded,andbindstoantigen;(4)substrateisadded,andisconvertedbyenzymetodetectableform.測定孔EEEEE底物溶液对照孔EEEEEEEEEEEEEEE酶标记物底物溶液參考液(不含抗原)EE樣本(含抗原)CompetitiveELISAAthirduseofELISAisthroughcompetitivebinding.ThestepsforthisELISAaresomewhatdifferentthanthefirsttwoexamples:Unlabeledantibodyisincubatedinthepresenceofitsantigen.Theseboundantibody/antigencomplexesarethenaddedtoanantigencoatedwell.Theplateiswashed,sothatunboundantibodyisremoved.(Themoreantigeninthesample,thelessantibodywillbeabletobindtotheantigeninthewell,hence"competition.")Thesecondaryantibody,specifictotheprimaryantibodyisadded.Thissecondantibodyiscoupledtotheenzyme.Asubstrateisadded,andremainingenzymeselicitachromogenicorfluorescentsignal.ELISA实验过程1.实验试剂的准备 按试剂盒说明书的要求准备实验中需用的试剂。ELISA实验中应用蒸馏水或去离子水，自配的缓冲液的PH应用pH计进行较正。从冰箱中取出的试验用试剂应待温度与室温平衡后使用。试剂盒中本次试验不需用的部分应及时放回冰箱保存。2.加样 在ELISA实验中一般有5次加样步聚，即加标准品、加样本、加酶标记物、加底物、加反应终止液。加样时应将所加物加在LEISA板孔的底部，避免加在孔壁上部，并注意不可溅出，不可产生气泡。

加样时一般用微量加样器，按规定的量加入板孔中。每次加标本应更换吸嘴，以免发生交叉污染。加酶结合物应用液和底物应用液时可用定量多道加液器，使加液过程迅速完成。3.保温 在ELISA中一般加标本和加酶标记物后会有一次抗原抗体反应。抗原抗体反应的完成需要有一定的温度和时间，这一保温过程称为温育(incubation)。 ELISA属固相免疫测定，抗原、抗体的结合只在固相表面上发生。加入板孔中的标本，其中的抗原并不是都有均等的和固相抗结合的机会，只有最贴近孔壁的一层溶液中的抗原直接与抗体接触。这是一个逐步平衡的过程，因此需经扩散才能达到反应的终点。在其后加入的酶标记抗体与固相抗原的结合也同样如此。这就是为什么ELISA反应总是需要一定时间的温育。

温育常采用的温度有43℃、37℃、室温和4℃（冰箱温度）等。为了便于操作目前绝大部分的试剂盒均采用室温进行温育反应，操作时的室温应严格限制在规定的范围内，标准室温温度是指20-25℃，但具体操作时可根据说明书的要求控制温育。室温温育时，ELISA板只要平置于操作台上即可。应注意温育的温度和时间应按规定力求准确。4.洗涤 洗涤在ELISA过程中虽不是一个反应步骤，但却也决定着实验的成败。ELSIA就是靠洗涤来达到分离游离的和结合的酶标记物的目的。通过洗涤以清除残留在板孔中没能与固相抗原或抗体结合的物质，以及在反应过程中非特异性地吸附于固相载体的干扰物质。聚苯乙烯等塑料对蛋白质的吸附是普遍性的，而在洗涤时又应把这种非特异性吸附的干扰物质洗涤下来。可以说在ELISA操作中，洗涤是最主要的关键技术，应引起操作者的高度重视，操作者应严格按要求洗涤，不得马虎。

洗涤的方式除某些ELISA仪器配有特殊的自动洗涤仪外，手工操作主要为浸泡式，过程如下：

a.吸干或甩干孔内反应液；b.用洗涤液过洗一遍（将洗涤液注满板孔后，即甩去）；c.浸泡，即将洗涤液注满板孔，放1-2分钟，间歇摇动，浸泡时间不可随意缩短；d.吸干孔内液体。吸干应彻底，可用水泵或真空泵抽吸，也可甩去液体后在清洁毛巾或吸水纸上拍干；e.重复操作c和d，洗涤3-4次（或按说明规定）。在间接法中如本底较高，可增加洗涤次数或延长浸泡时间。5.显色和比色5.1显色 显色是ELISA中的最后一步温育反应，此时酶催化无色的底物生成有色的产物。反应的温度和时间仍是影响显色的因素。在定量测定中，加入底物后的反应温度和时间应按规定力求准确。 底物显色一般在室外温或37℃反应20-30分钟后即不再加深，约40分钟将达到显色的顶峰，再延长反应时间，可使本底值增高。底物液受光照会自行变色，显色反应应避光进行，显色反应结束时加入终止液终止反应。产物用各类酸性终止液终止后会使蓝色转变成黄色，此时可用特定的波长（450nm）测读吸光值。5.2比色 比色前应先用洁净的吸水纸拭干板底附着的液体，然后将板正确放入酶标比色仪的比色架中。

比色结果的表达以往通用光密度（oplicaldensity，OD），现按规定用吸光度（absorbence，A），两者含义相同。通常的表示方法是，将吸收波长写于A字母的右下角，如TMB的吸收波长为450nm，表示方法为"A450nm"或"OD450nm"。

酶联免疫技术（ELISA）比传统的检测技术具有灵敏度高、特异性好、快速、方法操作简单、样品处理量大、使用范围宽、检测费用低、易商品化等优点。因此可以肯定，酶联免疫在食品领域必将得到广泛的应用。ELISA在食品检测中的应用（1）检测食品中的毒素目前发现能引起人中毒的霉菌代谢产物至少有150种以上，常见的产毒性真菌有曲霉菌属、青霉菌属、镰刀菌属等，其中最常见且研究最多的是黄曲霉毒素、超曲霉毒素等。例如有报道利用酶联免疫法测定酱油中黄曲霉毒素B1(AFTB1)。过去酱油的AFTB1测定多采用限量法，指标仅限于≤5μg/kg。有学者做了检测证明，利用酶联免疫测定法测定，最低检出限为0.1ng/ml，如果采用样品稀释法排除干扰，稀释50倍可排除共存物的干扰，按稀释50倍算，最小检出物浓度为50ng/ml。（2）检测食品中的残留农药在美国已将其作为饮用水的检测指标之一，规定最大残留量为0.04mg/l。用酶联免疫试剂盒检测克百威，已有报道最低检测限为0.01mg/l，线性检测范围为0.01～10mg/l，回收率高于90%。用酶联免疫法检测杀虫剂克百威残留较常规的仪器分析具有操作简便、灵敏度高、特异性强等的优点。（3）检测食品中的微生物目前，传统的微生物检测方法仍然是食品中的常用方法，但是存在操作繁琐、时间长、工作量大等缺点，对大部分微生物来说，用传统的检测方法至少要4～5d，有些致病的微生物甚至无法进行人工培养。各类肉品易受多种致病微生物的污染。其中沙门氏菌使人畜共患肠道病原菌和细菌性食物中毒重要的病原菌。原有的常规检测方法，存在操作复杂、需要特殊的仪器、检测时间长等弊端。因而开始有学者开始利用酶联免疫吸附检测法检测沙门氏菌。该方法比常规的培养法提前3～4d，不需要特殊的实验设备，肉眼即可观察结果，且样品易保存。（4）检测食品中的其它成分免疫球蛋白指具有抗体活性、能与相应的抗原发生特异性结合的球蛋白，是构成体液免疫的重要物质。牛乳中特别是初乳中免疫球蛋白的含量特别高，最近开发的免疫乳，就是通过对乳牛进行免疫注射从而提高牛乳中免疫球蛋白的含量。因免疫球蛋白也是一种蛋白质，具有蛋白质的共性，但其在上述制品中的含量又相对较少，常规的蛋白质的测定方法无法测出免疫球蛋白的含量。用酶联免疫法即可成功解决这个问题，且同时完成含量与活性的检测。ELISA在国外研究进展Shearera.L.通过实验证实了ELISA应用于BFDV（一种导致鹦鹉的嘴和羽毛病变的病毒）的检测中与先前一直应用的HI试验相比，试验过程（对于样品的处理等）大为简化，而且ELISA试验结果更加准确。2008SachaStelzer-Braid在这篇文章中，通过试验发现ELISA可以进行抗H5抗体快速检测以适应临床需要。但同时发现ELISA在进行H5抗体检测的过程中会受到H3N2和H1N1的联合作用而呈现出假阳性。由于肉类产品在加工过程中掺假行为时有发生，同时考虑到以下三个方面的原因：首先肉类掺假会使经济波动，其次某些消费者有可能会发生变态反应，第三宗教的原因。从以上三点出发，我们就应该考虑到一种方法，来鉴定肉的真实性或是可靠性。由于ELISA的快速专一等优点，很快使其在这一领域大显身手。有学者就对熟肉制品的来源进行了ELISA的分析(Ayaz,Y.,Ayaz,N.D.,&Erol,I.(2006).Detectioninmeatandmeatproductsusingenzyme-linkedimmunosorbentassay.JournalofMuscleFoods,17,214.)同样在鱼类食品深加工的过程中，也存在外形被破坏后无法进行种类识别的问题。而这种问题的存在往往导致一定的商业欺骗，如将一些不值钱的小鱼混充值钱的鱼类做成罐头。因此进行这一方面的研究也是有必要的，而Rehbein等人通过研究证实了ELISA再鱼种类的检测上与PCR技术比起来要简单而且有效，更适合于大规模的生产应用。【Rehbein,H.,Sotelo,C.G.,Pe´rez-Martı´n,R.I.,Chapela-Garrido,M.J.,Hold,G.L.,Russell,V.J.,etal.(2002).DifferentiationofraworprocessedeelbyPCR-basedtechniques:Restrictionfragmentlengthpolymorphismanalysis(RFLP)andsinglestrandconformationpolymorphismanalysis(SSCP).EuropeanFoodResearchandTechnol-ogy,214,171–177.】在牛奶制备奶酪的过程中掺假的行为会导致诸如变态反应、宗教、道德等方面的问题。比如在以羊奶为原料的高级奶酪的制备过程中，常常有人会用一些山羊奶加上牛奶来冒充原料。而利用ELISA方法的可靠性和敏感性就可以检测出那些造假的奶酪。Hurley等人就通过ELISA的方法在一些未注明含有牛奶的羊奶和水牛奶中将其检测出来。【Hurley,I.P.,Coleman,R.C.,Ireland,H.E.,&Williams,J.H.H.(2004).MeasurementofbovineIgGbyindirectcompetitiveELISAasameansofdetectingmilkadulteration.JournalofDairyScience,87,215–221.】果汁造假的现象时有发生，比如掺水或是掺入一些人造的成分。随着果汁化学成分的研究深入，人们逐渐向果汁中加入一些果皮的提取物或是兑入一些廉价的果汁。而为了保证消费者的权利，杜绝这种现象，就要求有一种安全、快速、可靠的检测技术。Sass-Kiss在柚子汁和橘子汁方面的掺假检验方面做了深入的研究。【Sass-Kiss,A.,&Sass,M.(2000).Immunoanalyticalmethodforqualitycontroloforangejuiceproducts.JournalofAgriculturalandFoodChemistry,48,4027–4031.Sass-Kiss,A.,&Sass,M.(2002).Distributionofvariouspeptidesincitrusfruits(grapefruit,lemon,andorange).JournalofAgriculturalandFoodChemistry,50,2117–2120.】转基因食品的不确定因素很多，如它或许可能会引起某些人的变态反应，因此在包装时要进行标注。而有些厂家并不在意这一点，这实际上是一种欺骗行为。为了规范转基因食品的市场，需要一种可靠的检测手段能够准确地检测出某种食品中是否含有转基因成分。ELISA在一些半成品或是生食中可以做为转基因食品的检测手段，但是对于完全加工的产品来说，由于转基因表达出来的蛋白质降解，导致ELISA不能够认定该食品是否是转基因食品。而大量的研究也都证实了这一点。【Terry,C.F.,Harris,N.,&Parkes,H.C.(2002).Detectionofgeneticallymodifiedcropsandtheirderivatives:Criticalstepsinsamplepreparationandextraction.JournalofAOACInternational,85,768–774.】【Margarit,E.,Reggiardo,M.I.,Vallejos,R.H.,&Permingeat,H.R.(2006).DetectionofBTtransgenicmaizeinfoodstuffs.FoodResearchInternational,39,250–255.】辐照作为一种是食品加工技术主要应用在杀菌、延长某些蔬菜的贮藏期