免疫荧光实验方法及难点详解

5/5免疫荧光实验方法及难点详解荧光免疫技术是标记免疫技术中发展最早的一种。很早以来就有一些学者试图将抗体分子与一些示踪物质结合，利用抗原抗体反应进行组织或细胞内抗原物质的定位。跟小析姐一起来学习下荧光免疫技术吧~由于一般荧光测定中的本底较高等问题，荧光免疫技术用于定量测定有一定困难。近年来发展了几种特殊的荧光免疫测定，与酶免疫测定和放射免疫分析一样，在临床检验中应用。

荧光

（一）荧光的产生

一此化学物质能从外界吸收并储存能量（如光能、化学能等）而进入激发态，当其从激发态再回复到基态时，过剩的能量可以电磁辐射的形式放射（即发光）。荧光发射的特点是：可产生荧光的分子或原子在接受能量后即刻引起发光；而一旦停止供能，发光（荧光）现象也随之在瞬间内消失。可以引起发荧光的能量种类很多，由光激发所引起的荧光称为致荧光。由化学应所引起的称为化学荧光，由X线或阴极射线引起的分别称为X线荧光或阴极射线荧光。荧光免疫技术一般应用致荧光物质进行标记。

（二）荧光效率

荧光分子不会将全部吸收的光能都转变成荧光，总或多或少地以其他形式释放。荧光效率是指荧光分子将吸收的光能转变成荧光的百分率，与发射荧光光量子的数值成正比。

荧光效率＝发射荧光的光量分子数（荧光强度）／吸收光的光量子数（激发光强度）

发射荧光的光量子数亦即荧光强度，除受激发光强度影响外，也与激发光的波长有关。各个荧光分子有其特定的吸收光谱和发射光谱（荧光光谱），即在某一特定波长处有最大吸收峰和最大发射峰。选择激发光波长量接近于荧光分子的最大吸收峰波长，且测定光波量接近于最大发射光波峰时，得到的荧光强度也最大。

（三）荧光的猝灭

荧光分子的辐射能力在受到激发光较长时间的照射后会减弱甚至猝灭，这是由于激发态分子的电子不能回复到基态，所吸收的能量无法以荧光的形式发射。一些化合物有天然的荧光猝灭作用而被用作猝灭剂，以消除不需用的荧光。因此荧光物质的保存应注意避免光（特别是紫外光）的直接照射和与其他化合物的接触。在荧光抗体技术中常用一些非荧的色素物质如亚甲蓝、碱性复红。伊文思蓝或低浓度的过锰酸钾、碘溶液等对标本进行得当复染，以减弱非特异性荧光本质，使特异荧光更突出显示。

（四）荧光物质

许多物质都可产生荧光现象，但并非都可用作荧光色素。只有那些能产生明显的荧光并能作为染料使用的有机化合物才能称为免疫荧光色素或荧光染料。常用的荧光色素有：

1．异硫氰酸荧光素（fluoresceinisothiocyanate，FITC）为黄色或橙黄色结晶粉末，易溶于水或酒精等溶剂。分子量为389.4，最大吸收光波长为490495nm，最大发射光波长520530nm，呈现明亮的黄绿色荧光，结构式如下：

荧光素标记

(一)原理目前用于抗体标记的荧光素主要有异硫氰酸荧光素(Fluoresceinisothiocynate,FITC)或罗达明(LissaminerhodamineB200,RB200)。在硷性条件下FITC的碳酰胺键可与抗体赖氨酸的ε氨基共价结合，标记后的抗体仍保持与相应抗原结合的能力。在荧光灯源紫外线或兰紫光激发下产生黄绿色荧光，通过在荧光显微镜下观察或流式细胞仪分析可对相应抗原进行定性、定位或定量的检测。

(二)操作步骤将纯化的IgG抗体对PH9～9.5碳酸盐缓冲液透析过夜，透析后抗体液移入小烧杯中↓称取适量IFTC，加入二甲亚砜(DMSO)(FITC～1mg/1mlDMSO)使终浓度为1mgFITC／1mlDMSOFITC／IgG比例:如IgG浓度为1mg／ml，FITC／IgG比例约为50μgFITC／mgIgG；如IgG为5～10mg／ml，则比例为25μgFITC／mlIgG在10ml小烧杯中先放入抗体↓按上述比例将FITC-DMSO溶液逐滴加入透析后的抗体溶液中↓将标记物用PBS加至2.5ml，磁力搅拌器室温下避光搅拌2h↓用PD10柱(SephadexG25柱)除去游离荧光素，先用25mlPBS淋洗G25柱↓收集PBS洗脱第一个荧光素结合蛋白峰，测定F／P比值。第二个荧光素峰为游离荧光素计算:2.87×A495F／P＝───────────A280-0.35×A495合适的F／P值为2～4。

(三)试剂器材1.纯化的多克隆抗体或单克隆抗体。2.FITC(Fluorescein-5-Lsothiocyanalte)或其它荧光色素。3.PBS、DMSO4.PH9～9.5碳酸盐缓冲液:Na2CO34.3g，NaHCO38.6g加蒸馏水至500ml。5.PD10柱(SephadexG25柱)6.磁力搅拌器，紫外分光光度计等

(四)注意事项1.FITC保存于4℃暗处，使用前待试剂瓶升至室温时开盖称