微生物与免疫学04 实验四 酶联免疫吸附实验 ELISA课件

实验五酶联免疫吸附实验免疫酶技术免疫酶技术是将抗原抗体反应的特异性与酶的高效催化作用有机结合的一种方法。它以酶作为标记物，与抗体（或抗原）联结，与相应的抗原（或抗体）作用后，通过底物的颜色反应作抗原抗体的定性和定量，亦可用于组织中抗原或抗体的定位研究，即酶免疫组织化学技术。目前应用最多的免疫酶技术是酶联免疫吸附实验（ELISA）。ELISA简介1971年瑞典学者Engvall和Perlmann，荷兰学者VanWeeman和Schuurs分别报道将免疫技术发展为检测体液中微量物质的固相免疫测定方法，称为酶联免疫吸附实验（ELISA）ELISA检测抗原

Ag+ Ab*Ag-Ab*ELISA检测抗体

Ab+ Ag*Ab-Ag*ELISA检测抗体(间接法)Ag+Ab1Ag-Ab1Ag-Ab1+Ab2*Ag-Ab1-Ab2*由于结合在抗原—抗体复合物上的荧光抗体显著多于直接法，从而提高了敏感性。如细胞抗原上每个分子结合3～5个分子抗体，当此抗体作为抗原时又可结合3—5分子的荧光抗体，所以和直接法相比荧光亮度可增强3或4倍。此法除灵敏性高外，它只需要制备一种种属间接荧光抗体，可以适用于多种第一抗体的标记显示，这是现在最广泛应用的技术。间接法比直接法灵敏酶标仪将抗原HBsAg吸附于载体表面（厂家已经完成）加入酶复合物，(HBsAg-HRP),酶复合物与表面抗体结合加入酶的底物，酶与底物反应，显色二、ELISA间接法检测血清中HBsAg原理同检测抗体,但小孔底部包被的为HBsAb酶复合物为:HBsAb-HRP当标本中存在HBsAg时，就会形成HBsAb-HBsAg-HBsAb-HRP复合物，加入TMB(四甲基联苯胺)底物产生显色反应，反之就无显色反应。【实验材料】1．乙肝病毒HBsAg（或HBsAb）酶联免疫诊断试剂盒。

预包被微孔条（用纯化的单抗-HBs或纯化HBsAg包被）酶结合物（多克隆抗-HBs-HRP或HBsAg-HRP）阳性对照阴性对照洗涤液(浓缩液，用前以蒸馏水稀释25倍)显色剂A、B（一般为四甲基联苯胺和H2O2）终止液（2mol/LH2SO4）。2．微量加样器，吸水纸等。①检测HBsAg或HBsAb的反应条②酶标抗体③阴性对照血清④阳性对照血清⑤洗涤液⑥显色液(A,B)ELISA试剂盒包含以下各组分：实验步骤每4人一组，每组有检测HBsAg和检测HBsAb的反应条各一条,每条含6个反应孔。每组有2种试剂盒(黄色测HBsAg,粉红色测HBsAb),黄色试剂盒用黄色反应条,粉红色试剂盒用红色反应条。3、检测方法每孔加待检血清50ul,每次实验各做1个阴性对照和阳性对照;本实验空白对照孔不设，前面讲台上有空白的反应条，可以作为空白对照。注意：每位同学选择一种待测血清进行检测（见下图）。(2)每孔加1滴酶结合物,充分混匀，37℃孵育30min(3)甩弃孔内液体（在水池中甩弃，不要在实验室中随地甩弃）；(4)每孔加满洗涤液,静置1min,甩干。同上洗涤重复5次，拍干。(6)每孔加显色液A,B各1滴,充分混匀，置37℃15min.按以下方法,进行肉眼观察结果:

阴性对照孔无色,阳性对照孔蓝色;

待测孔显蓝色,为阳性,否则为阴性。(7)加终止液（本实验不加终止液）HBV属于嗜肝DNA病毒科，是乙型肝炎的病原体。在中国，HBV感染或携带者已超过1.3亿，发病人数超过3000万人。HBV基因组为双链环状DNA，其中有一个单链区。HBV的抗原组成由表面抗原（HBsAg）、核心抗原(HBcAg)和e抗原(HBeAg)组成。三种抗原具有其相应抗体：HBsAb（抗表面抗原抗体）、HBeAb（抗e抗原抗体）、HBcAb（抗核心抗原抗体）。HBsAg为二聚体糖蛋白，大量存在于感染者血液中，为HBV感染的主要标志；HBcAg存在于Dane颗粒核心结构表面，为内壳成分，其外被HBsAg覆盖，不易在血循环中检出，但能刺激机体产生抗-HBc，抗-HBcIgM的存在提示HBV处于复制状态；HBeAg游离于血中，其消长与病毒体消长及DNA多聚酶消长基本一致，故HBeAg为HBV复制及具有强感染性的一个指标；HBeAg刺激机体产生的抗-HBe能与受染肝细胞表面的HBeAg结合，通过补体介导破坏受染肝细胞，抗-HBe的出现是预防后良好的象征。HBV的主要感染源是患者或无症状的HBsAg携带者，通过血液、体液、母婴传播。本实验只检测HBsAg及其抗体HBsAb【注意事项】1．试剂盒应于4℃存放，在有效期内使用。2．微孔条须密封防潮，从冷藏环境中取出时,应在室温中平衡至潮气尽干后方可开封启用，余者及时封存。3．滴加试剂前应将瓶摇匀，使液体混匀。滴加时瓶身应保持垂直，以使滴量准确，注意勿将试剂滴在孔壁上。4．洗涤时各孔均须加满，防止孔口内有游离酶未能洗净。5．待测标本不可用NaN3防腐。所有样品都应按传染源处理。观看实验录像临床ELISA测定中可能会出现的问题及可能的原因

（非试剂盒本身的原因）

1．弱阳性样本检测不出

温育的时间或温度不够；显色反应时间太短；所用配制缓冲液的蒸馏水有问题

2．测定的重复性差

（相同样本两次测定结果不一致）

这是典型的由测定操作引起的问题，包括

（1）加样本及试剂量不准；孔间不一致；

（2）加样过快，孔间发生污染；

（3）加错样本；

（4）加样本及试剂时，加在孔壁上部非包被区；

（5）不同批号试剂盒中组分混用；

（6）温育时间、洗板、显色时间不一致；

（7）孔内污染杂物；

（8）酶标仪滤光片不正确；

（9）血清标本未完全凝固即加入，反应孔内出现纤维蛋白凝固或残留血细胞，易出现假阳性反应等。

3．白板

（阳性对照不显色）

（1）漏加酶结合物；