天然活性物质课件

第2章天然活性物质制备技术第1节概述 第2节天然活性物质提取技术一、传统提取技术

(一)溶剂提取法（二）水蒸气蒸馏法（三）升华法（四）分子蒸馏技术二、现代提取技术

(一)超临界流体萃取法（二）超声波提取技术（三）微波辐射提取分离方法天然活性物质制备技术的研究过程中，所关心和研究的主要问题是：如何使有效成分得以保留，如何保证天然活性物质的安全有效，如何求证工艺的科学性和合理性。

第1节概述

天然活性物质成分复杂，有效成分往往不明确，且有效成分含量低，有的药效作用常是多靶点综合作用，因此对天然活性物质进行提取、分离和纯化显得十分重要。

天然活性物质制备方法按其形成先后和应用普遍程度可分为：1）传统提取技术：溶剂提取法（煎煮法、浸渍法、渗漉法、回流提取法）、水蒸气蒸馏法、分子蒸馏法

2)现代提取技术：超临界流体萃取技术、超声波提取技术、微波提取技术、仿生提取技术、酶法提取技术、加压逆流提取法、固相微萃取技术天然活性物质制备的方法：(一)溶剂提取法1、溶剂提取法的原理

根据天然活性物质中各种成分在溶剂中的溶解性质不同，选用对活性成分溶解度大，对不需要溶出成分溶解度小的溶剂，将有效成分从天然活性物质组织内溶解出来，即相似相溶原理。

蘑菇型提取罐相似相溶第2节天然活性物质提取技术一、传统提取技术2、溶剂的选择

运用溶剂提取法的关键，是选择适当的溶剂。溶剂选择适当，就可以比较顺利地将需要的成分提取出来。选择溶剂要注意以下三点：①溶剂对有效成分溶解度大，对杂质溶解度小；②溶剂不能与天然活性物质的成分起化学变化；③溶剂要经济、易得、使用安全等。单双联过滤器常见的提取溶剂可分为以下三类：

（1）极性有机溶剂：含有羟基或羧基等极性基团的溶剂。如水、甲酸、甘油、二甲基亚砜等。水是一种典型的强极性溶剂（介电常数ε=80），且价廉易得，使用安全，故为常用溶剂。

天然活性物质中亲水性的成分，如无机盐、糖类、分子不太大的多糖类、鞣质、氨基酸、蛋白质、有机酸盐、生物碱盐及甙类等都能被水溶出。

不锈钢板框压滤机

（3）非极性有机溶剂：一般与水不能混溶的有机溶剂，如石油醚、苯、氯仿、乙醚、乙酸乙酯、二氯乙烷等。这些溶剂的选择性能强，不能或不容易提出亲水性杂质。但这类溶剂挥发性大，多易燃（氯仿除外），一般有毒，价格较贵，设备要求较高，且它们透入植物组织的能力较弱，往往需要长时间反复提取才能提取完全。如果天然活性物质中含有较多的水分，用这类溶剂就很难浸出其有效成分，因此，大量提取天然生物活性物质原料时，直接应用这类溶剂有一定的局限性。双效浓缩器（2）渗漉法：将天然生物活性物质粉末装在渗漉器中，不断添加新溶剂，使其渗透过活性物质，自上而下从渗漉器下部流出浸出液的一种浸出方法。在大量生产中常将收集的稀渗漉液作为另一批新原料的溶剂之用。渗漉器

当溶剂渗进药粉溶出成分比重加大而向下移动时，上层的溶液或稀浸液便置换其位置，造成良好的浓度差，使扩散能较好地进行，故浸出效果优于浸渍法。在渗漉过程中，控制流速，随时补充新溶剂，使活性物质中有效成分充分浸出为止。当渗滴液颜色极浅或渗涌液的体积相当于原活性物质重的10倍时，便可认为基本上已提取完全。

（3）煎煮法：是我国最早使用的传统的浸出方法。所用容器一般为陶器、砂罐或铜制、搪瓷器皿，不宜用铁锅，以免药液变色。直火加热时最好时常搅拌，以免局部活性物质受热太高，容易焦糊。有蒸汽加热设备的药厂，多采用大反应锅、大铜锅、大木桶，或水泥砌的池子中通入蒸汽加热。还可将数个煎煮器通过管道互相连接，进行连续煎浸。全自动煎煮锅

煎煮法

（4）回流提取法：应用有机溶剂加热提取，需采用回流加热装置，以免溶剂挥发损失。小量操作时，可在圆底烧瓶上连接回流冷凝器。瓶内溶剂浸过活性物质表面约1～2cm。在水浴中加热回流，一般保持沸腾，放冷过滤，再在药渣中加溶剂，作第二、三次加热回流分别约半小时，或至基本提尽有效成分为止。此法提取效率较冷浸法高，大量生产中采用连续提取法。（5）连续提取法

应用挥发性有机溶剂提取天然生物活性物质有效成分，不论小型实验或大型生产，均以连续提取法为好，其需用溶剂较少，提取成分较完全。实验室常用脂肪提取器或称索氏提取器但是，连续提取法，提取成分受热时间较长，对于遇热不稳定易变化的成分则不宜采用此法。半微量提取装置索氏提取器提取装置分液漏斗振摇方法准备样品

称取原料，用滤纸包好，放入索式提取器的套筒中。安装仪器样品抽提筒蒸汽上升管虹吸管滤纸套管

（二）水蒸气蒸馏法

水蒸气蒸馏法是利用被蒸馏分与水不相混溶，且被分离的物质能在比水沸点低的温度下沸腾，生成的蒸汽和水蒸气一同逸出，经凝结后得到水－油两液层，达到分离的目的。

一、传统提取技术

A为水蒸气发生器B为安全管C为液位计D为蒸馏瓶E为蒸气导入管G为螺旋夹F为与冷凝管连接的导管，30°角H为回收瓶水蒸气蒸馏装置水蒸气蒸馏法主要用于中草药中的挥发油、一些小分子的生物碱(如麻黄碱、烟碱、槟榔碱等)和小分子酚类物质(如丹皮酚)等的分离和提取。水蒸气蒸馏法不会对设备和操作条件有苛刻的要求，污染小，能耗适中，工业应用价值很大，但是水蒸气蒸馏仅限于简单蒸馏，或者是过热水蒸气作为惰性气的载气蒸馏。

固体物质受热直接气化，遇冷后又凝固为固体化合物，称为升华。天然生物活性物质中有一些成分具有升华的性质，故可利用升华法直接自天然生物活性物质中提取出来。如樟木中樟脑，茶叶中咖啡碱。一、传统提取技术（三）升华法

1、原理

根据分子运动理论,通过加热，获得足够能量的分子逸出液面，轻分子的平均自由程大，重分子平均自由程小，若在离液面小于轻分子的平均自由程而大于重分子平均自由程处设置一冷凝面，使得轻分子不断被冷凝，从而破坏了轻分子的动平衡而使混合液中的轻分子不断逸出，重分子因达不到冷凝面很快趋于动态平衡，不再从混合液中逸出,而达到分离的目的。自由程：一个分子相邻两次碰撞之间所走的路程一、传统提取技术（四）分子蒸馏技术不同物质受热后分子运动的平均自由程存在差异，从而实现物质的分离。分子蒸馏器的模式离心薄膜式转子刮膜式主要区别在于物料形成薄膜的方法不同现在国内、外的工业化装置以转子刮膜式为主2、分子蒸馏器的模式冷阱又称冷凝捕集器，是利用低温冷壁来捕集可凝性蒸气的一种低温冷凝捕集器。冷阱被广泛应用于高真空和超高真空系统中，安装在主泵入口和真空室之间的管路上。冷阱不仅能有效地捕集来自蒸气流泵的返流蒸气和部分裂解物，而且还可抽除来自真空室内的可凝性蒸气。4.基本工作过程

进料液体在真空状态下进入蒸馏器中，并迅速被展开成薄膜，向下到蒸发表面。加热壁（桔红色部分）和高真空（黄色部分）驱使较易挥发的成份（蒸馏物）到接近的内置冷凝器，同时不易挥发的成份（残物）继续顺着蒸馏柱向下运动。这样分离出来的分馏物通过单独的卸料出口出来。

分子蒸馏实验室设备

工厂分子蒸馏系统

5、分子蒸馏技术的特点（教材24页）1.酸性氯化物2.氨基酸酯3.葡萄糖衍生物4.吲哚5.萜酯6.天然和合成维生素7.互叶白千层油8.辣椒碱9.大蒜素的精制10.川芎11.当归姜油中草药有效成分的提纯制药6、分子蒸馏技术应用领域和提取的产品1．脂肪酸及衍生物2.二聚酯肪酸3.鱼油4.小麦胚芽油5．种子油6.单甘油酯7.双甘油酯8.黄油食品1．广藿香油2.玫瑰油3.山仓子油4.桉叶油（茶树油）5.香茅油6.橙油7.紫罗兰酮香料香精

（一）超临界流体萃取技术1、超临界流体(SCF)

任何一种物质都存在三种相态-气相、液相、固相。三相成平衡态共存的点叫三相点。液、气两相成平衡状态的点叫临界点。不同的物质其临界点所要求的压力和温度各不相同。

二、现代提取技术

超临界流体(Supercriticalfluid，SCF):是指物质处于临界温度和临界压力以上时所处的单一相态。在超临界状态下，流体性质介于气体和液体之间，既具有与气体接近的黏度及高的扩散系数，又具有液体相近的密度。超临界流体的性质

物理特征密度（g/cm3）粘度（g/cm/s）扩散系数（cm2/s）气体（0.6-2）*10-3（1-4）*10-40.1-0.4)*10-2液体0.6-1.6（0.2-3）*10-2（0.2-2)*10-5SCF超临界流体0.2-0.9（1-9）*10-4（0.2-0.7)*10-3超临界流体的主要特性

密度类似液体；粘度和扩散系数接近于气体；压力和温度的变化均可改变相变(临界点附近)。2、超临界流体萃取技术

SCF具有高度的选择性溶解物质的能力，并随着临界条件（T，P）而变化，可从混合物中有选择地溶解其中的某些组分，然后通过减压，升温或吸附将其分离析出。

超临界流体萃取技术（SFE）：是指在一定温度条件下，应用超临界流体作为萃取溶剂，利用程序升压对不同成分进行分步萃取的技术，是利用SCF作为萃取剂的一种高效萃取技术。3.超临界流体萃取的基本原理和方法基本概念临界温度（Tc）：物质无论处于多高压力下均不能被液化的最低温度。临界压力(Pc)：与Tc相对应的压力称为临界压力。超临界区域：在压力和温度图中，高于临界温度和临界压力的区域称为超临界区。超临界流体：如果流体被加热或被压缩至高于临界点时，则该流体即为超临界流体。超临界点时的流体密度称为超临界密度(ρc)，其倒数称为超临界比容(Vc)。3.超临界流体萃取的基本原理和方法萃取原理：利用超临界流体的溶解能力与其密度的关系，即利用压力和温度对超临界流体溶解能力的影响进行物质的分离。方法：在超临界状态下，将超临界流体与待分离的物质接触，使其有选择性地把极性大小、沸点高低和分子量大小的成分依次萃取出来。因此，对应各压力范围所得到的萃取物不可能是单一的，但可以控制条件得到最佳比例的混合成分，然后借助减压、升温的方法使超临界流体变成普通气体，被萃取物质则完全或基本析出，从而达到分离提纯的目的，所以超临界流体萃取过程是由萃取和分离组合而成的。4.超临界流体萃取的性质超临界流体的P－V－T性质超临界流体的传递性质超临界流体的溶解能力超临界流体的萃取选择性超临界流体的P－V－T性质稍高于临界点温度的区域，压力稍有变化，即引起密度的很大变化，这时，超临界流体密度已接近于该物质的液体密度，而此时的状态仍为气态，因此，超临界流体具有高的扩散性，与液体溶剂萃取相比，其过程阻力大大降低。

超临界流体的P－V－T性质，图中以CO2为例的P－－T相图。T为三相点。

P-T图c点：临界点(CriticalPoint)，该点表示纯物质汽-液两相可以共存的最高温度Tc和最高压力Pc。在图中高于Tc和Pc，由虚线隔开的区域成为密流区，密流区的流体称超临界流体或简称流体，在这个区域流体的属性不同与气体也不同于液体，它具有特殊的属性。气气P-T图P-V图气P-V图P-V图P-V-T图P-V-T关系P-V-T关系P-V-T关系超临界流体的传递性质

由于超临界流体的自扩散系数大，粘度小，渗透性好，与液体萃取相比，可以很快地完成传质，达到平衡，促进高效分离过程的实现。超临界流体的溶解能力

超临界流体的溶解能力，与密度有很大关系，在临界区附近，操作压力和温度的微小变化，会引起流体密度的大幅度变化，因而也将影响其溶解能力。超临界流体的萃取选择性

超临界技术对萃取剂的要求及提高萃取剂选择性的基本原则是：按相似相溶原则，选用的超临界流体与被萃取物质的化学性质越相似，溶解能力就越大。从操作角度看，使用超临界流体为萃取剂时的操作温度越接近临界温度，溶解能力也越大。萃取剂本身为惰性，且对人体和原料完全无害。萃取剂具有适当的临界压力，以减少压缩费用，且具有低的沸点。5、超临界CO2作为萃取剂的具体特点对分子量大于500道尔顿的物质具有一定的溶解度。对中、低分子量的卤化碳、醛、酮、酯、醇、醚是非常易溶的。对低分子量的物质是可溶的。如对非极性的脂族烃(20碳以下)及小分子的芳烃化合物是可溶的。对分子量很低的极性有机物(如羧酸)是可溶的。酰胺、脲、氨基甲酸乙酯、偶氮染料的溶解性较差。具有无毒无害、不易燃易爆；低粘度、低表面张力、低沸点、合理临界特性等。6.超临界CO2萃取中的提携剂在超临界流体萃取过程中，由于二氧化碳是非极性物质，比较适合于脂溶性物质的萃取，但对极性较强的物质来说，其溶解能力明显不足，此时，为增加二氧化碳流体的溶解性能，通常在其中加入少量极性溶剂，以增加其溶解能力，这种溶剂称为提携剂（entrainer），也称夹带剂或修饰剂(cosolvent，modifier)。提携剂通常是有机溶剂，它可以是某一种纯物质，也可以是两种或多种物质的混合物。7.超临界流体萃取过程中的系统及操作特性

超临界流体萃取系统的组成溶剂压缩机(即高压泵)萃取器温度、压力控制系统分离器和吸收器其他辅助设备包括：辅助泵、阀门、背压调节器、流量计、热量回收器等。

CO2气瓶压力调节阀热交换器萃取器热交换器分离器计量阀过滤器压力表防爆片减压阀流量计超临界萃取的系统超临界萃取过程主要包括萃取阶段和分离阶段。在萃取阶段，超临界流体将所需组分从原料中萃取出来；在分离阶段，通过改变某个参数，使萃取组分与超临界流体分离，从而得到所需的组分并可使萃取剂循环使用。超临界萃取的典型流程超临界CO2流体萃取分离工艺流程方框图8、常见的三种超临界萃取流程示意图等温法等压法吸附法第一种方式是控制系统的温度（等温法）。超临界萃取是在产品溶质溶解度为最大时的温度下进行，然后萃取液通过热交换器使之冷却，将温度调节可以在分离器中加以收集，溶剂可经再压缩进入萃取器循环使用。第二种方式是控制系统的压力（等压法）。富含溶质的萃取液经减压阀降压，溶质可在分离器中分离收集，溶剂也经再压缩循环使用或者径直排放。第三种方式即吸附方式（吸附法）。它包括在定压绝热条件下，溶剂在萃取器中萃取溶质，然后借助合适的吸附材料如活性炭等以吸收萃取液中的溶剂。9、超临界CO2萃取系统的主要应用

脱咖啡因啤酒花萃取动植物油的萃取分离

脱咖啡因生产过程：先用机械法清洗咖啡豆，去除灰尘和杂质;接着加蒸汽和水预泡，提高其水分含量达30%～50%;然后将预泡过的咖啡豆装入萃取罐，不断往罐中送入CO2(操作湿度70～90℃，压力16～20MPa，密度0.4～0.65g/cm2)，咖啡因就逐渐被萃取出来。带有咖啡因的CO2被送往清洗罐，使咖啡因转入水相。然后水相中咖啡因用蒸馏法加以回收，CO2则循环使用。啤酒花萃取：把啤酒花磨成粉状，使之更易与溶剂接触。然后装入萃取罐，密封后通入超临界CO2，操作温度35～38℃，压力8～30MPa。达到萃取要求后，浸出物随CO2一起被送至分离罐，经过降压分离得到含浸膏99%的黄绿色产物，其有用成份是挥发性油和软树脂中的葎草酮及α-酸，从而获得高质量、富含风味物的浸膏。10.超临界流体技术的优点超临界流体具有较高的扩散性，从而减小了传质阻力，这对多孔疏松的固态物质和细胞材料中的化合物的萃取特别有利超临界流体对改变操作条件(如压力、温度)特别敏感，这就提供了操作上的灵活性和可调性超临界流体可在低温下进行，对分离热敏性物料尤为有利超临界流体具有低的化学活泼性和毒性。（二）超声波提取技术

超声波是指频率为20kHz～50MHz左右的电磁波，它是一种机械波，需要能量载体—介质，来进行传播。超声提取是利用超声波(频率>20KHz)具有的机械效应、空化效应及热效应，通过增大介质分子的运动速度，增大介质的穿透力以提取中药有效成分的技术。1、超声提取技术原理：(a.机械效应)超声波在介质中的传播可以使介质质点在其传播空间内产生振动，从而强化介质的扩散、传质，即超声波的机械效应。组织细胞变形植物蛋白变性生物分子解聚超声波

传播辐射压强分子摩擦微激波(b.空化效应)介质内部溶解的微气泡在超声波的作用下增大，形成共振腔，然后瞬间闭合，即超声波的空化效应。微气泡超声波增大共振腔形成植物细胞破裂瞬间闭合成分

溶出介质及药材组织导

致(c.热效应)超声波在传播过程中，声能不断被介质所吸收，并全部或大部分转化成热能，导致介质本身和药材组织温度升高，促使有效成分的溶解，这就是超声波的热效应。超声波

传播声能热能介质

吸收促

使温度升高2、超声提取技术——优点提取过程不需要加热提取过程为物理过程溶剂用量少提取物有效成分含量高适用于热敏物质节省能源不影响有效成分的生理活性有效成分的提取率高利于精制超声波中药提取机超声波中药处理机（三）微波辐射提取分离方法1、微波提取的原理和特点原理：在快速振动的微波电磁场中，被辐射的极性物质分子吸收电磁能，以每秒数十亿次的高速振动产生热能，导致植物细胞内的极性物质，尤其是水分子吸收微波能，产生大量热量，使细胞内温度迅速上升，液态水汽化产生的压力将细胞膜和细胞壁冲破，形成微小的孔洞；进一步加热，导致细胞内部和细胞壁水分减少，细胞收缩，表面出现裂纹。孔洞和裂纹的存在使胞外溶剂容易进入细胞内，溶解并释放出胞内产物。

特点：投资少、设备简单、适用范围广、重现性好、选择性高、操作时间短、溶剂耗量少、有效成分得率高、不产生噪音、不产生污染。与传统煎煮法相比，克服了药材细粉易凝聚、易焦化的弊端。

溶媒量1:4，药汁浓度高，浓缩收膏用时少，收膏率高。100Kg生药提取成本底于常规提取20～30%。2、微波提取的装置和条件

微波提取的条件包括溶剂、功率和提取时间。1、被提取的成分是微波自热物质，有一定的极性。2、溶剂必须对微波透明或半透明，介电常数在8～28范围内。3、物料中的含水量对微波能的吸收关系很大。若物料不含水分，选用部分吸收微波能的萃取介质。第3节天然活性物质分离纯化技术举例一、纸层析（PPC）二、薄层层析法（TLC）

薄层色谱扫描仪的工作原理

用一束长宽可以调节的一定波长、一定强度的光照射到薄层斑点上进行整个斑点的扫描，用仪器测量通过斑点或被斑点反射的光束强度的变化从而达到定量的目的。

经过一段时间毛细管作用的移动，不同的物质就彼此分开，从而获得分离。三、柱层析

（一）吸附色谱(adsorptionchromatography)原理：依据吸附剂对混合物中各成分吸附性能的不同，使各成分得到分离。常用吸附剂：硅胶、氧化铝、活性炭与聚酰胺.1）硅胶、氧化铝柱色谱：二者均为最常用的吸附剂。硅胶是一种中等极性的酸性吸附剂，适用于中性或酸性成分的层析。氧化铝有弱碱性，主要用于碱性或中性亲脂性成分的分离，如生物碱、甾、萜类等成分；对于生物碱类的分离颇为理想。但是碱性氧化铝不宜用于醛、酮、酸、内酯等类型的化合物分离。硅胶彩色硅胶柱装置（2）聚酰胺吸附色谱法吸附原理：通过分子中的酰胺羰基与酚类、黄酮类化合物的酚羟基，或以酰胺键上的游离胺基与醌类、脂肪酸上的羰基形成氢键缔合而产生吸附。应用范围：a.特别适合于酚类、黄酮类物质制备和分离。b.脱鞣质处理；c.也可用于生物碱、萜类、甾类、糖类、氨基酸等物质的分离。(3）凝胶过滤色谱（gelfiltrationchromatography）1、原理：系利用分子筛原理分离物质的一种方法，其中所用载体为葡聚糖凝胶等。①

葡聚糖凝胶SephadexG交联葡聚糖结构②羟丙基葡聚糖凝胶SephadexLH-20

※

SephadexLH-20为SephadexG-25经羟丙基化处理后得到的产物（具醚键形式）-OH→-OCH2CH2CH2OH※

SephadexLH-20分子中-OH数量无改变，但碳原子所占比例却相对增加了；※

不仅可以在水中应用，也可在极性有机溶剂或它们与水组成的混合溶剂中膨润使用。应用范围①SephadexG主要用于分离糖、蛋白、苷。②SephadexLH-20多用于分离苷和苷元。

四、大孔吸附树脂（1）吸附原理：①吸附性：大孔吸附树脂本身具有吸附性，是由范德华力或氢键吸附的结果。②筛性原理：是由大孔吸附树脂本身的多孔性所决定的。（2）组成：※非极性型以苯乙烯为母体，二乙烯苯为交联剂；※中极性型以2-甲基苯烯酸甲酯为母体，二乙烯苯为交联剂。

（3）影响吸附的因素A、非极性化合物在水中易被非极性大孔树脂吸附；极性化合物在水中易被极性大孔树脂吸附。B、物质在溶剂中的溶解度大，树脂对此物质的吸附力就小；反之就大。C、能与大孔吸附树脂形成氢键的化合物易被吸附。

（4）洗脱剂：对非极性大孔树脂，洗脱剂极性越小，洗脱能力越强，对中极性大孔树脂及极性较大化合物，则极性较大溶剂洗脱力强。一般上样后先用水（或酸、碱水）洗去杂质，然后用不同浓度的含水醇、甲醇、乙醇、丙酮等依次洗脱。

（5）应用范围A、苷类与糖类的分离；B、生物碱的精制；C、多糖、黄酮类、三萜类化合物的分离等。※注意事项：A、大孔吸附树脂使用前需要用乙醇预处理；B、水溶液上柱，醇梯度洗脱。

五、离子交换色谱离子交换反应的原理是树脂与被交换成分间同种电荷离子的等当量替代作用。以离子交换树脂为固定相，水或酸水、碱水为流动相，在流动相中的离子性物质与树脂进行交换而被吸附，再用适合溶剂将被交换成分从树脂上洗脱下来即可。离子交换树脂的分类阳离子交换树脂：◆强酸性阳离子交换树脂（-SO3-H+）◆弱酸性阳离子交换树脂（-COO-H+）阴离子交换树脂◆强碱性阴离子交换树脂（-N+(CH3)3Cl-）◆弱碱性阴离子交换树脂例如：-NH2、仲胺、叔胺基等离子交换层析的基本步骤中药中的碱性成分可用阳离子交换树脂交换,酚\酸性成分可用阴离子交换树脂交换,将交换后的树脂通过调整酸碱环境使吸附物游离,选择适当溶剂将吸附物溶解出即可。由于被交换的混合物成分的酸性或碱性不同而解离度不同，与同一离子交换树脂的交换能力不同而被分离。六、铅盐沉淀法该法主要是根据分子中某些特定官能团能与铅盐生成沉淀而进行分离。

把目标物质从第一个液相中依靠更强大的溶解力抽提到第二个液相中。物质的溶解：相似相溶原理。萃取是通过溶质在两个液相之间的竟争性溶解（分配）而实现的。七、溶剂萃取有很大的萃取容量；良好的选择性；与被萃取的液相（通常是水相）互溶度要小，且粘度低、界面张力小或适中，有利于相的分散和两相分离；溶剂的回收和再生容易；化学稳定性好，不易分解，对设备腐蚀性小；价廉易得；安全性好，闪点高，对人体无毒性或毒性低。一个良好的溶剂要满足以下要求：生物工业上常用的溶剂有酯类、醇类和酮类等。

影响萃取操作的因素：温度pH值溶媒比盐分乳化程度温度↑互溶性增大；温度↓产物稳定性提高，粘度增加，扩散性能减小。影响分配系数，影响物质解离情况溶媒比＝溶媒体积/萃取体积溶媒比↑萃取效果↑溶媒回收费用↑盐分↑分配系数↑尽量破坏乳浊液，如轻度乳化，要加热过滤离心（热敏物质不用加热）；重度乳化，加SDS、溴化十五烷基吡啶等去乳化剂。工业萃取方式工业萃取的流程混合分离溶剂回收混合器（如搅拌混合器）分离器（如碟片式离心机）溶剂回收装置（如蒸馏塔）料液F与萃取溶剂S一起加入混合器内搅拌混合萃取，达到平衡后的溶液送到分离器内分离得到萃取相L和萃余相R，萃取相送到回收器，萃余相R为废液。在回收器内产物与溶剂分离（如蒸馏、反萃取等），溶剂则可循环使用。1.单级萃取萃取器分离器回收器FSRP（产物）使用一个混合器和一个分离器的萃取操作：为提高收率常采用多级萃取，多级萃取又有多级逆流萃取和多级错流萃取的区别。

2.多级萃取多级错流萃取流程的特点：每级均加新鲜溶剂，故溶剂消耗量大，得到的萃取液产物平均浓度较稀，但萃取较完全；混合分离器1混合分离器2混合分离器n料液溶剂萃取液萃余液萃余液萃取液萃取液萃余液溶剂溶剂多级逆流萃取流程的特点：料液走向和萃取剂走向相反，只在最后一级中加入萃取剂，萃取剂消耗少，萃取液产物平均浓度高，产物收率较高。工业上多采用多级逆流萃取流程。混合分离器1混合分离器2混合分离器n料液产物＋溶剂萃余液萃余液废液溶剂3、乳化和去乳化

乳化产生后会使有机溶剂相和水相分层困难，出现两种夹带，即发酵液废液中夹带有机溶剂微滴和溶剂相中夹带发酵液的微滴，前者意味着发酵单位的损失，后者会给以后的精制造成困难。离心机分离也不能将两相分离完全，所以必须破坏乳化。乳化一种液体（分散相）分散在另一种不相混溶的液体（连续相）中的现象。乳化的结果可能形成两种形式的乳浊液：一种是水包油型（O/W），另一种为油包水型（W/O）。

在发酵液中，蛋白质是引起乳化的最重要的表面活性物质。由蛋白质引起的乳化多为水包油型（O/W）。

当表面活性剂的亲水基团强度大于亲油基团，易生成水包油型（O/W）乳浊液；反之则易生成油包水型（W/O）乳浊液。

生产过程出现的乳浊液是水包油型（O/W），还是油包水型（W/O），主要由表面活性剂的性质决定。破乳的方法有很多：过滤或离心分离破乳法、化学法、物理法（加热、稀释、吸附等）、转型法（如在O/W中加入亲油性乳化剂，使乳化液有生成W/O的倾向，但又不稳定，从而达到破乳目的）。破乳化最好的方法是防止乳化，应设法去除蛋白质。有机溶剂萃取的不足：许多蛋白质都有极强的亲水性，不溶于有机溶剂；蛋白质在有机溶剂相中易变性失活。八、双水相萃取1.双水相萃取的优点（１）使固液分离和纯化两个步骤同时进行，一步完成；（２）适合热敏物质的提取，主要是胞内酶；（３）亲水性聚合物加入水中，形成两相，在这两相中，水分占大比例（85～95％），生物活性的蛋白质在两相中不会失活，并以一定比例分配于两相中。2.双水相的形成1）如两种聚合物间存在强的吸引力，则它们结合后存在于一相中；如两种聚合物间有斥力，即某种分子希望在它周围的分子是同种分子而不是异种分子，达到平衡后会形成两相，两种聚合物各处一相。2）加入盐分，由于盐析作用，聚合物与盐类溶液也能形成两相。常用聚合物：聚乙二醇－葡聚糖聚乙二醇－无机盐系统无毒原则3.影响分配的系数1）聚合物的分子量2）聚合物的浓度3)盐类4)pH值分子量越小，蛋白质容易分配于富含该聚合物的相中。当接近分配的临界点蛋白质均匀分配于两相中，分配系数接近1；成相聚合物的总浓度或聚合物/盐浓度的比例增加时，系统远离平衡点，此时两相性质的差别增加，蛋白质容易趋向于某一极。盐浓度增加促使蛋白质两极分化对物质解离度影响九、梯度pH萃取法梯度pH萃取法适合于酸性强弱不同的黄酮苷元的分离。根据黄酮类苷元酚羟基数目及位置不同其酸性强弱也不同的性质，可以将混合物溶于有机溶剂（如乙醚）后，依次用5%NaHCO3、5%Na2CO3、0.2%NaOH及4%NaOH水溶液萃取，来达到分离的目的。十、高效液相色谱法HPLC(HighPerformanceLiquidChromatography)是一种区别于经典液相色谱,基于仪器方法的高效能分离手段:高性能色谱柱,高精度输液泵,高灵敏度检测器…广泛应用于各个领域:医药,环保,石化,生命科学,食品工业,农业…无论在技术上,理论上,还是在应用上仍有较大的发展空间。液相色谱仪器结构与流程（见附件）高效液相色谱的固定相

高效液相色谱固定相以承受高压能力来分类，可分为刚性固体和硬胶两大类。

刚性固体以二氧化硅为基质，可承受7.0108～

1.0109Pa的高压，可制成直径、形状、孔隙度不同的颗粒。如果在二氧化硅表面键合各种官能团，可扩大应用范围，它是目前最广泛使用的一种固定相。

硬胶主要用于离子交换和尺寸排阻色谱中，它由聚苯乙烯与二乙烯苯基交联而成。可承受压力上限为3.5108Pa。

固定相按孔隙深度分类，可分为表面多孔型和全多孔型固定相两类。1.表面多孔型固定相它的基体是实心玻璃球，在玻璃球外面覆盖一层多孔活性材料，如硅胶、氧化硅、离子交换剂、分子筛、聚酰胺等。这类固定相的多孔层厚度小、孔浅，相对死体积小，出峰迅速、柱效亦高；颗粒较大，渗透性好，装柱容易，梯度淋洗时能迅速达到平衡，较适合做常规分析。由于多孔层厚度薄，最大允许量受到限制。2.全多孔型固定相由直径为10nm的硅胶微粒凝聚而成。这类固定相由于颗粒很细（5～10m），孔仍然较浅，传质速率快，易实现高效、高速。特别适合复杂混合物分离及衡量分析。液相色谱的流动相

1.流动相特性（1）液相色谱的流动相又称为：淋洗液，洗脱剂。流动相组成改变，极性改变，可显著改变组分分离状况；（2）亲水性固定液常采用疏水性流动相，即流动相的极性小于固定相的极性，称为正相液液色谱法，极性柱也称正相柱。（3）若流动相的极性大于固定液的极性，则称为反相液液色谱，非极性柱也称为反相柱。组分在两种类型分离柱上的出峰顺序相反。

2.流动相类别

按流动相组成分：单组分和多组分；按极性分：极性、弱极性、非极性；按使用方式分：固定组成淋洗和梯度淋洗。常用溶剂：甲醇、己烷、四氯化碳、甲苯、乙酸乙酯、乙醇、乙腈、水。采用二元或多元组合溶剂作为流动相可以灵活调节流动相的极性或增加选择性，以改进分离或调整出峰时间。3.流动相选择

在选择溶剂时，溶剂的极性是选择的重要依据。采用正相液-液分配分离时：首先选择中等极性溶剂，若组分的保留时间太短，降低溶剂极性，反之增加。也可在低极性溶剂中，逐渐增加其中的极性溶剂，使保留时间缩短。常用溶剂的极性顺序：水(最大)>甲酰胺>乙腈>甲醇>乙醇>丙醇>丙酮>二氧六环>四氢呋喃>甲乙酮>正丁醇>乙酸乙酯>乙醚>异丙醚>二氯甲烷>氯仿>溴乙烷>苯>四氯化碳>二硫化碳>环己烷>己烷>煤油(最小)。4.流动相的要求高效液相色谱中流动相是液体，它对组分有亲合力，参与固定相对组分的竞争，正确选择流动相直接影响组分的分离度。对流动相溶剂的要求是：（1）溶剂对于待测样品，必须具有合适的极性和良好的选择性。（2）溶剂与检测器匹配。对于紫外吸收检测器，应注意选用检测器波长比溶剂的紫外截止波长要长。所谓溶剂的紫外截止波长指当小于截止波长的辐射通过溶剂时，溶剂对此辐射产生强烈吸收，此时溶剂被看作是光学不透明的，它严重干扰组分的吸收测量。对于折光率检测器，要求选择与组分折光率有较大差别的溶剂作流动相，以达到最高灵敏度。（3）高纯度由于高效液相色谱灵敏度高，对流动相溶剂的纯度也要求高。不纯的溶剂会引起基线不稳，或产生“伪峰”。（4）化学稳定性好（5）低粘度（粘度适中）若使用高粘度溶剂，势必增高压力，不利于分离。常用的低粘度溶剂有丙酮、甲醇和乙腈等；但粘度过低的溶剂也不宜采用，例如戊烷和乙醚等，它们容易在色谱柱或检测器内形成气泡，影响分离。十一、膜分离技术

陶瓷心聚丙烯超细纤维典型的膜分离技术有:微孔过滤(MF)超滤(UF)反渗透(RO)纳滤(NF)渗析(D)电渗析(ED)液膜(LM)渗透蒸发(PV)等，微孔过滤技术1.微孔过滤和微孔膜的特点微孔过滤技术始于十九世纪中叶，是以静压差为推动力利用筛网状过滤介质膜的“筛分”作用进行分离的膜过程。实施微孔过滤的膜称为微孔膜。微孔膜是均匀的多孔薄膜，厚度在90～150μm左右，过滤粒径在0.025～10μm之间，操作压在0.01～0.2MPa。到目前为止，国内外商品化的微孔膜约有13类，总计400多种。

微孔膜优点：①孔径均匀，过滤精度高。能将液体中所有大于制定孔径的微粒全部截留；②孔隙大，流速快。一般微孔膜的孔密度为107孔/cm2，微孔体积占膜总体积的70％～80％。由于膜很薄，阻力小，其过滤速度较常规过滤介质快几十倍；③无吸附或少吸附。微孔膜厚度一般在90～150μm之间，因而吸附量很少，可忽略不计。④无介质脱落。微孔膜为均一的高分子材料，过滤时没有纤维或碎屑脱落，因此能得到高纯度的滤液。

微孔膜缺点：①颗粒容量较小，易被堵塞；②使用时必须有前道过滤的配合，否则无法正常工作。2.微孔过滤技术应用领域（1）微粒和细菌的过滤。可用于水的高度净化、食品和饮料的除菌、药液的过滤、发酵工业的空气净化和除菌等。（2）微粒和细菌的检测。微孔膜可作为微粒和细菌的富集器，从而进行微粒和细菌含量的测定。（3）气体、溶液和水的净化。大气中悬浮的尘埃、纤维、花粉、细菌、病毒等；溶液和水中存在的微小固体颗粒和微生物，都可借助微孔膜去除。（4）食糖与酒类的精制。微孔膜对食糖溶液和啤、黄酒等酒类进行过滤，可除去食糖中的杂质、酒类中的酵母、霉菌和其他微生物，提高食糖的纯度和酒类产品的清澈度，延长存放期。常温操作，不会使酒类产品变味。（5）药物的除菌和除微粒。药物采用热压法灭菌时，细菌的尸体留在药品中。热敏性药物如胰岛素、血清蛋白等不能采用热压法灭菌。经过微孔膜过滤后，细菌被截留，无细菌尸体残留药物中。常温操作不引起药物受热破坏和变性。许多液态药物如注射液、眼药水等，用常规的过滤技术难以达到要求，必须采用微滤技术。超滤技术1.超滤和超滤膜的特点超滤技术始于1861年，其过滤粒径介于微滤和反渗透之间，约5～10nm，在0.1～0.5MPa的静压差推动下截留各种可溶性大分子，如多糖、蛋白质、酶等相对分子质量大于500的大分子及胶体，形成浓缩液，达到溶液的净化、分离及浓缩目的。超滤技术的核心部件是超滤膜，分离截留的原理为筛分，小于孔径的微粒随溶剂一起透过膜上的微孔，而大于孔径的微粒则被截留。膜上微孔的尺寸和形状决定膜的分离效率。

超滤膜均为不对称膜，形式有平板式、卷式、管式和中空纤维状等。超滤膜的结构一般由三层结构组成。上层表面活性层:致密而光滑，厚度为0.1～1.5μm，其中细孔孔径一般小于10nm；

中间过渡层:具有大于10nm的细孔，厚度一般为1～10μm；下层支撑层，厚度为50～250μm，具有50nm以上的孔。支撑层的作用为起支撑作用，提高膜的机械强度。膜的分离性能主要取决于表面活性层和过度层。制备超滤膜的材料主要有聚砜、聚酰胺、聚丙烯腈和醋酸纤维素等。超滤膜的工作条件取决于膜的材质，如醋酸纤维素超滤膜适用于pH3～8，三醋酸纤维素超滤膜适用于pH2～9，芳香聚酰胺超滤膜适用于pH5～9，温度0～40℃，而聚醚砜超滤膜的使用温度则可超过100℃。2.超滤膜技术应用领域（1）纯水的制备。除去水中细菌、病毒和其他异物，制备高纯饮用水、电子工业超净水和医用无菌水等。（2）汽车、家具等制品电泳涂装淋洗水处理。汽车、家具等制品的电泳涂装淋洗水中常含有1％～2％的涂料（高分子物质），用超滤装置可分离出清水重复用于清洗，浓缩的涂料重新用于电泳涂装。（3）食品工业中的废水处理。（4）果汁、酒等饮料的消毒与澄清。（5）在医药和生化工业中用于处理热敏性物质，分离浓缩生物活性物质，从生物中提取药物等。（6）造纸厂的废水处理。反渗透技术对高浓度水溶液加压，使高浓度水溶液与低浓度水溶液的压差大于渗透压，则高浓度水溶液中的水将通过半透膜流向低浓度水溶液，此过程为反渗透。反渗透技术所分离的物质的分子量一般小于500，操作压力为2～100MPa。用于实施反渗透操作的膜为反渗透膜。反渗透膜大部分为不对称膜，孔径小于0.5nm，可截留溶质分子。渗透与反渗透原理示意图制备反渗透膜的材料主要有醋酸纤维素、芳香族聚酰胺、聚苯并咪唑、磺化聚苯醚、聚芳砜、聚醚酮、聚芳醚酮、聚四氟乙烯等。反渗透膜技术应用领域

反渗透过程主要是从水溶液中分离出水，分离过程无相变化，不消耗化学药品，这些基本特征决定了它的应用范围。

（1）海水、苦咸水的淡化制取生活用水，硬水软化制备锅炉用水，高纯水的制备。

（2）在医药、食品工业中用以浓缩药液、果汁、咖啡浸液等。与常用的冷冻干燥和蒸发脱水浓缩等工艺比较，反渗透法脱水浓缩成本较低，而且产品的疗效、风味和营养等均不受影响。

（3）印染、食品、造纸等工业中用于处理污水，回收利用废业中有用的物质等。

反渗透与超滤、微孔过滤的比较反渗透、超滤和微孔过滤都是以压力差为推动力使溶剂通过膜的分离过程，它们组成了分离溶液中的离子、分子到固体微粒的三级膜分离过程。一般分离溶液中分子量低于500低分子物质用反渗透膜；分离溶液中分子量大于500大分子或极细胶体粒子选超滤膜，分离溶液中直径0.1～10μm粒子选微孔膜。反渗透膜、超滤膜和微孔膜之间的分界并不是十分严格、明确的，它们之间可能存在一定的相互重叠。反渗透、超滤和微孔过滤技术的原理和操作特点比较分离技术类型反渗透超滤微孔过滤膜的形式表面致密的非对称膜、复合膜等非对称膜，表面有微孔微孔膜膜材料纤维素、聚酰胺等聚丙烯腈、聚砜等纤维素、PVC等操作压力/MPa2～1000.1～0.50.01～0.2分离的物质分子量小于500的小分子物质分子量大于500的大分子和细小胶体微粒0.1～10μm的粒子分离机理非简单筛分，膜的物化性能对分离起主要作用筛分，膜的物化性能对分离起一定作用筛分，膜的物理结构对分离起决定作用水的渗透通量/(m3.m-2.d-1)0.1～2.50.5～520～200结晶是制备纯物质的有效方法。在生物技术中，结晶主要应用于抗生素、氨基酸、有机酸等小分子的生产中，以作为精制的一种手段。固体有结晶和无定形两种状态，两者的区别在于它们的构成单位的排列方式不同，前者有规则，后者无规则。由于只有同类分子或离子才能排列成晶体，故结晶过程有很好的选择性，析出的晶体纯度较高。十二、结晶与重晶技术物质在溶解时一般要吸收热量，在结晶时放出热量，称为结晶热。相反的情况，即溶解时放热，结晶时吸热，比较少见。因此结晶又是一个同时有质量和热量传递的过程。结晶包括三个过程：形成过饱和溶液；晶核形成；晶体生长。溶液达到过饱和是结晶的前提，过饱和度是结晶的推动力。

结晶的过程过饱和溶液形成方法将热饱和溶液冷却。将部分溶剂蒸发。化学反应结晶。盐析结晶。工业生产实例（1）采用第四种方法结晶（2）并用第一、第四种方法结晶（3）并用第二、第一种方法结晶（4）并用第一、第三种方法结晶多粘菌丝E：多粘菌素E的脱盐脱色液，以弱碱性树脂中和至近中性，加等量丙酮，其硫酸盐就结晶析出。利用丝裂霉素在甲醇种溶解度较大、在苯中较小的性质，将其粗品溶于少量甲醇中，加入2倍体积的苯，5℃放置过夜，就可得蓝紫色结晶。制霉菌素：制霉菌素得乙醇提取液真空浓缩10倍，冷至5℃放置2h，即可得结晶。四环素碱：四环素酸性溶液，用氨水调pH至4.8，冷却至10℃，2h后，四环素游离碱就可结晶析出。晶核的形成根据机理不同，可以分为两种，即初级成核和二次成核。前者为无晶种存在时，而后者则为有晶种存在时产生。

晶核的形成在过饱和溶液中，能量在某一瞬间、某一区域暂时达到较高值容易形成晶核；成核速度随温度升高而升高，达到最大值后，温度再升高，速度下降；成核速度和离子种类有关，阳离子或阴离子化合价增加，越不容易形成晶核，在相同的化合价下，含结晶水越多，越不容易成核。有机物质，结构越复杂，分子量越大，成核速度越慢；机械振动、搅拌促使成核，电磁场、超声波、紫外光等都能促进成核；加入晶体能诱导结晶。晶体种类有序的无序、无定形的成晶过程很快成晶过程缓慢

重结晶原理：固体有机物在溶剂中的溶解度与温度有密切关系。利用溶剂对纯物质及杂质的溶解度不同，使被提纯物质从过饱和溶液中析出，而让杂质全部或大部分仍留在溶液中，从而达到提纯的目的。注意——重结晶只适宜杂质含量在5%以下的固体有机混合物的提纯。从反应粗产物直接重结晶是不适宜的，必须先采取其他方法初步提纯，再重结晶提纯。1、选择适宜的溶剂

选择溶剂根据“相似相溶”原理。溶剂应符合的条件：(1)溶剂不应与重结晶物质发生化学反应；(2)重结晶物质在溶剂中的溶解度应随温度变化，即高温时溶解度大，而低温时溶解度小；(3)杂质在溶剂中的溶解度或者很大，或者很小；(4)溶剂应容易与重结晶物质分离；(5)溶剂应无毒，不易燃，价格合适并有利于回收利用。

2、制热饱和溶液制热饱和溶液时，溶剂可分批加入，边加热边搅拌，在溶剂沸点温度下，至固体完全溶解后，再多加2O％左右（这样可避免热过滤时，晶体在漏斗上或漏斗颈中析出造成损失）。切不可再多加溶剂，否则会损失产品或冷后析不出晶体。（有机溶剂需要回流装置）。

若溶液含有色杂质，要加活性炭脱色。（用量为粗产品质量的1%～5%）——待溶液稍冷后加活性炭！！（切不可在沸腾的溶液中加入活性炭，那样会有暴沸的危险。）煮沸5～10分钟。

结晶设备第四节微生物转化UM-BBD（TheUniversityofMinnesotaBiocatalysis/BiodegradationDatabase）

美国明尼苏答大学生物催化/生物降解数据库

UM-BBD提供生物化学中重要的关于微生物酶催化反应的信息。/~lynda/index.html

从20世纪50年代开始，微生物学家通过有机化学、物理学、生物化学和遗传基因学等学科的帮助，研究了微生物代谢产物中的化学组成以及生命活动中酶和酶的化学反应使生物学科向分子水平发展；同时提供了微生物学向化学学科的渗透。微生物学研究者应用现代的生物技术帮助生物化学和有机化学工作者解决一些复杂和疑难的微生物代谢产物和化学合成的反应．创造出不少人工合成的新化合物，推动了生物化学和有机化学的发展。微生物转化是通过微生物细胞将复杂的底物进行结构修饰，也就是利用微生物谢过程中产生的某个或某一系列的酶对底物特定部位(基团)进行的催化反应。(microbialtransformationormicrobialbioconversion)。一、微生物转化的反应随着现代生物技术的不断进步，特别是固定化细胞、诱变和基因重组等的发展，使微生物转化的转化率成倍提高，也为天然药物结构修饰带来了广大的发展空间。不同类的微生物都含有不同的酶系。目前应用和研究上用得比较多的微生物按化学反应分类。1．应用于氧化反应

(1)脱氢反应应用于脱氢反应的主要是细菌(2)羟基化反应

应用于羟基化反应的主要是放线菌2、应用于水解反应应用于水解反应的主要是细菌、酵母菌和霉菌3、应用于还原反应应用于还原反应的主要是酵母菌和霉菌。4、应用于酰基化反应应用于酰基化反应的主要是细菌5、应用于降解反应应用于降解反应的主要是细菌6、应用于脱水反应应用于脱水反应的主要是细菌和霉菌二、微生物转化的一般过程微生物转化过程：选择需要的菌株培养成熟菌丝或孢子选择合适的转化方式转化培养或转化菌丝及孢子悬浮液转化转化液的分离提取产品纯化1．选择菌种选择好的菌种是做好微生物转化反应的关键；根据微生物转化反应的类型，选择哪类微生物含这类反应的酶。一般可以向国家或地方保管菌种机构去函索取。2.制备培养基按微生物转化菌种的培养特征和转化反应需要配制培养基；一般要求培养基的成分能使菌丝生长丰满和富含需要的酶。3加转化底物加底物时有两个同等重要的影响因素：选择合适的菌种生长期加底物；选择加底物的方法和方式。4添加刺激剂或抑制剂添加抑制剂是抑制酶副反应或抑制其他反应不良酶的生长；添加刺激剂是提高酶活力和增加酶生长量。5控制好转化反应培养时间按有关微生物转化反应各种因素，控制好转化反应培养终点电，使底物转化达到最大反应完全值。6调控好影响因素调控好整个转化过程中各项影响因素。7控制好转化反应终点当取样分析反映转化培养液中转化产物积累不再增加时，立刻采用物理方法将菌丝体及培养物除去来停止转化反应。8分离纯化转化产物此时转化产物已与生物转化系统分开，可按化学方法将产物分离提纯三、几种常用的微生物转化方法随着固定化细胞、诱变和基因重组等重要的生物技术的发展，不仅使得微生物转化在天然药物修饰中发挥更重要的作用，使生物转化成倍地提高转化率，并且使得微生物转化方法更加丰富。

1、分批培养转化法分批培养(batchculture)转化法是在摇瓶和发酵罐中待菌体生长到一定阶段加入底物进行转化的方法。底物加入时间因菌种和底物不同而各异，一般在对数生长期，但也有在延迟期和稳定期加入的。2、利用酶进行生物转化直接从微生物体内或发酵液中将酶提出．在体外对底物进行生物催化。可以经过多步处理得到纯度较高的酶。也可以是粗酶。3、应用渗透细胞进行生物转化应用渗透细胞进行生物转化主要是促进底物渗入胞内，与酶充分接触，同时便于转化产物透出胞外，这种方法更适合于胞内酶作用的生物转化。增大细胞渗透性或改变细胞膜孔，一般采用表面活性剂或有机溶剂，有时也可利用抗生素来增加细胞膜的渗透性，但用量应适当控制，以免杀死微生物。4、应用孢子进行生物转化细菌的孢子一般无活性，而真菌的分生孢子和子囊孢子往往有较高的酶活力，与菌丝体比较具有杂质相对少的优点。孢子转化需要注意的是不能让孢子萌芽，否则不能保持稳定的生物转化活力。应用于生物转化的孢子悬浮液和培养基成分与静止细胞转化法相似．也是采用不完全培养基，仅含有缓冲液及葡萄糖等产生能量的碳源。5、应用固定化细胞进行生物转化目前常用的固定化方法有聚丙烯酰胺聚合法和卡拉胶包埋法。6、应用干燥细胞进行生物转化干燥细胞转化是另一种静息细胞转化法，便于贮备随时使用。干燥细胞的制备两种常用方法。①冰冻干燥法：将培养好的菌丝液，通过离心或过滤，洗涤后获得干净的菌丝体并重新悬浮于稀的缓冲液或纯水中，冰冻后抽真空，直接升华除去水分．得到蓬松的粉末。这种干燥菌丝体在冰冻保存的条件下可以保持活力达数年之久，适合于大规模的工业化生产。②丙酮干粉制备法：将菌丝体悬浮于一20℃的丙酮中处理3次，每次获得泥浆状的丙酮液，用抽气过滤进行收集，最后用冷乙醚洗涤，以帮助洗去残余的丙酮。丙酮干粉剂必须冰冻贮藏，以供随时使用。7静息细胞转化法：是指将微生物培养至一定阶段后分离出菌丝体，将其重新悬浮于不完全培养基(缺少某种营养物质，如氮源等)中，使其处于不再生长但仍保持原有各种酶活的状态，再加入底物，在适当的温度、pH和振荡条件下进行转化的方法。它是一种将生长影响减至最小的生物转化方法。四、微生物转化反应的特点微生物转化反应，可以用静止地按洗涤细胞进行研究．也可以用发酵方式进行转化以及应用固定化细胞进行生产等。它跟酶法转化和有机化学转化比较有以下特点

1、反应条件温和、公害少、设备简单且反应速度快2、可以减少反应步骤，如维生素c生物合成中基因重组葡萄糖酸氧化杆菌的代谢工程菌，将L-山梨醇脱氢酶基因和L-山梨酮脱氢酶基因，通过基因重组构建出一个工程菌株，发酵过程可以在同一次转化发酵中将D一山梨醇转化成α一酮一L古洛糖酸。3、对立体结构合成上具有高度的专一选择性微生物转化反应不仅对结构有化学选择性，还有区域选择性、面选择性和对映异构选择性。4、回收率高、成本低微生物转化反应是在细胞内进行，保持原来整体酶系比较符合生物催化所需环境和条件。在氧化一还原等催化反应时不需要添加辅酶；辅酶往往很不稳定，难以分离提取，从这点来说微生物转化比酶法转化要好多了。微生物反应可以持续进行、反应量大、回收率高并可以大规模工业化生产。从设备和原料方面来说生产成本低于酶法和化学合成法五、微生物转化的影响因素微生物转化反应本质上是一个酶反应。1、转化的时间和温度最佳反应时间确定：可以采用高效液相色谱(HPLC)、气相色谱(GC)、薄层扫描(TLCS)、分光光度法等定量分析手段。

温度也是影响转化率的一个重要因素。温度升高，转化率会提高，但超过一定的限度，会使得酶失活速率也加快，所以只有在一个适当的温度下转化，才能达到最佳转化率。最佳温度的选择也可通过上述分析检测手段来确定2、底物添加方法在微生物转化中，根据能否溶于水来分，可以把底物分为两大类，即可溶于水和不可溶于水底物。对于能溶于水的底物来说，将其添加到水的培养基中进行微生物转化是比较容易的，不过要注意加底物量的多少、添加速度和底物是否对微生物有毒性。添加底物的量一般与微生物转化反应的类型，细胞内含酶的多、少、强、弱和底物的化学性质有关；一般来说，非离子化合物的底物最大投料质量浓度约为10％，而离子型的底物为5％；

对于不能溶于水的底物来说，将其添加到水的培养基中要比添加能溶于水的底物难得多，但是随着现代化生物技术的广泛应用，目前已经有许多种解决方法了。①采用将底物制成细粉末状的固体直接投料。使得转化细胞和粉末底物之间有最好的接触表面积，转化率也会提高。在甾体转化中常用此法。②将不溶于水的底物溶于能溶于水的有机溶剂中进行添加。这类有机溶剂包括有低级醇(甲醇、乙醇)、丙酮和二甲基亚砜等；③采用非毒性表面活性物质米分散不溶性底物。通常应用聚山梨酯80(吐温一80)等非毒性表面活性物质来分散不溶性底物使得底物和转化液的接触面增大，来提高转化率。一般操作方法是先配制好表面活性荆质量浓度为3％的转化液，然后将不溶水的粉末状底物滴加分散到转化液中进行转化，必要时可用超声波促进分散程度。

3、酶的抑制剂：微生物转化过程中添加酶抑制剂是为了抑制转化过程中的副反应，保证获得转化的目的产物。采用微生物转化降解胆固醇侧链的方法制备甾体激素类药物重要中间体雄甾二酮过程中．通过添加含二价铁的螯合剂来抑制开裂甾体母核的副反应。4、酶的诱导剂微生物转化过程中，酶活力的总强度是细胞内含酶量乘以细胞总数。要增加酶活力不仅要增加细胞的投入量，还要诱导细胞内酶量的增加。酶的合成在整个细胞生命中是根据其生理上的需求来进行调控的。酶可以分为组成酶和诱导酶．组成酶是指在微生物的生长代谢过程中会自然产生的一些酶。对于组成酶来说，微生物转化的酶量主要与微生物的菌体量有关。而诱导酶是指在加入一定的诱导物后才会产生或明显地增加产量的一类酶。在微生物对数生长期容易被诱导物诱导产生，因此在对数生长期加入诱导剂是一个最好的时机。还有一个重要的规律是通常能被转化的底物都具有该转化酶的诱导作用5、生长调节剂生长调节剂(生物激素)对生物体代谢调节有显著影响。因此，在微生物转化过程中选择合适剂量的生长调节剂可以有效地提高底物的转化。六、微生物转化的应用

1、在有机合成领域的应用

微生物转化技术由于其高度立体及区域选择性在有机合成领域的应用已经取得了显著的效果,成为有机合成中的一个重要工具。根据Davis等研究，认为应用于微生物转化的酶主要是乙酰转移酶、糖苷酶、糖基转酶、环氧酶、羟基化酶、醛缩酶等。按照1961年国际生化会议的规定，根据酶催化的反应类型不同，酶可以分为六大类：①氧化还原酶类；②转移酶类；③水解酶类；④裂合酶类；⑤异构酶类；⑥合成酶(连接酶)类。在有机合成域主要是利用氧化还原酶类和水解酶类，大约有2／3的生物转化是蛋白酶、酯酶和脂肪酶起酯基和氨基的水解反应。

微生物转化应用于有机化合物的合成存在着许多优点，同时也有一些不足之处。最显著的优点就是高度选择性，包括化学选择性、区域选择性，非对映选择性、对映体选择性，还有反应条件温和，酶种类多样．酶量充足、转化效率高、产品质量稳定、对环境污染少等。缺点是在一些极端的反应条件下，如过高或过低的pH、温度和高盐的浓度下，酶均易失活．微生物转化反应就明显暴露出其不足之处。另外还存在产物和底物的抑制现象，有的底物或产物在一定的浓度下会抑制酶活，从而影响了转化效率。（1）手性化合物合成与拆分手性是生物体的基本特征，构成生命有机体的分子大都是不对称的手性分子。人体内在的手性环境可以识别手性药物对映体，使对映体在活性、代谢过程和毒性等方面存在显著差异。如用于消除孕妇早期妊娠反应的镇静剂“反应停”(thalidomide，沙利度胺)应用不久，就发现可致婴儿出现畸形，经研究发现具有镇静作用的是其R-对映体．而致畸变是由s-对映体引起的。因此必须对不同对映体看成不同的化合物进行研究。利用微生物转化对手性化台物的合成与拆分与化学拆分相比，有选择性高、步骤简单、成本低、产物回收率高等优点。典型的例子就是采用生物法半合成头孢菌素，通过利用酶的对映体催化专一性，只需两步就可以替代传统的化学生产法。（2）食品添加剂的合成最早在l935年，Reichstein就选用弱氧化乙酸杆菌(A.Suboxydans)将D一山梨醇转化为L-山梨糖，再经多步化学反应就合成得到Vc。20世纪70年代。我国学者发明了“二步发酵法”生产Vc，即在上述的乙酸杆菌转化后，再用氧化葡萄糖酸杆菌(Gluconobadteroxydans)和巨大芽孢杆菌(Bacillusmegaterium)的混合菌使得L-山梨糖转化为2-酮基-L-古龙酸。“二步发酵法”合成维生素c香草醛合成香草醛(vanillin)又称香兰素．是天然香料中最重要的一种。香料是食品、化妆品和制药工业的重要原料，香料占食品添加剂市场总量的25％左右。长期以来，人们热衷于从天然植物中提取香料，但是由于植物资源有限，含量低，提取困难，因而价格很昂贵。通过微生物转化方法合成香草醛．是一个典型的成功例子。以阿魏酸为反应起始物．利用芽孢杆菌、假单胞菌、链霉菌等多种微生物进行β一氧化产生香草酸，再通过诺卡氏菌(Nocardiasp.NRRL5646)中的羧基还原酶系选择性地将香草酸还原成香草醛。微生物转化法合成香草醛2、在新药开发中的应用新药合成主要是依靠化学合成和生物转化两种途径。化学合成途往主要是化学家们依据理论、自身经验及文献报道，主观地设计合成路线，因此在仿生性和立体结构选择性方面存在一定的难度，甚至很难实现；相反生物体经长期的演化进化，具有一套自身特异性的酶体系，使得生物转化合成物质的途径处于最佳状态。生物转化方法通常以天然活性成分为先导化合物．利用多种不同催化功能的酶系对其结构进行修饰，从而得到更多结构新颖的化合物，再通过活性筛选，可以寻找新的高效低毒的先导化合物．或通过对活性组分中不同成分结构变化与活性强度消长关系的分析发现关键活性成分。而我国天然药物资源比较丰富．用天然活性成分作为先导化合物寻找创新药物是一个非常可取的途轻．七、作为体外模型预测代谢药物代谢(drugmetabolish)是研究药物分子在体内以不同的规模发生的生物化学转化。药物经代谢后通常发生结构变化，从而引起相应的药理活性及毒性改变，例如代谢失活、代谢活化，它是直接影响药物发挥疗效的关键因素之一。大部分药物都是有机体的外源性物质，为了保证用药安全，必须充分了解药物在体内的吸收、分布、排泄以及生物转化等过程药物代谢反应从化学本质上可以分Ⅰ相(phaseⅠ)代谢反应和Ⅱ相(phaseⅡ)代谢反应两种类型。Ⅰ相代谢反应主要是官能团化(functionalization)，包括氧化、还原、水解等反应。药物经过Ⅰ相代谢反应后，极性基团引人药物分子，即在药物分子上形成羧基、羟基、氨基等基团．从而使药物分子水溶性增强，便于排泄，同时也改变了原有的官能团，使得药物解毒或活化。Ⅱ相代谢反应主要是结合反(conjugation)，包括葡萄糖醛酸结合、硫酸结合、谷胱甘肽结合等，药物极性进一步加大，有利于排出体外。体内代谢主要是在酶的参与下进行的，其代谢产物在体外很难通过化学方法合成，而微生物转化就是利用生物体内的酶系对外源性物质进行催化，形成其代谢产物，因此微生物转化已成为研究体内代谢的一种重要的辅助工具。Simth和Rosazza在研究芳香化合物的微生物羟基化时，注意到微生物代谢物和哺乳动物代谢物有相似性，并于1974年最先提出了“哺乳动物代谢的微生物模型”(microbialmodelsofmammalianmetabolism)的概念。其核心理论是：真菌和哺乳动物都是真核细胞生物，因此在主要的生理功能中含有类似的酶作用机制，所以两者在外源性化合物的代谢过程中就有相似的代谢系统和过程．因此，微生物转化在模拟哺乳动物药物代谢途径具有一定的预见性。利用微生物作为体外代谢模型研究哺乳动物代谢有以下优点：①微生物来源广泛．种类繁多，可提供大量的筛选模型；②建立微生物转化系统，成本较低，操作简单，易于控制；③可以通过调节优化条件，显著提高代谢产物的收率，经过分离纯化后，可以作为代谢产物的对照品进行药理和毒理研究；④可以减少实验动物用量八、新技术在微生物转化的中应用随着现代生物科学和生物技术的迅速发展，以及一些分析测试技术的应用，微生物转化也得到了进一步的发展。基因工程技术、固定化细胞转化技术、双水相转化技术、超声波技术、有机介质微生物转化以及生物反应器等综合应用于微生物转化反应体系，不仅可使转化的效率成倍增长，而且还有可能使整个反应过程连续、自动化。同时，一些分析测试技术如核磁共振、质谱等已经应用于微生物转化的在线检测。几种天然药物的微生物转化一、雷公藤内酯中药雷公藤来源于卫矛科植物雷公藤TriptelygiumwitfordiiHook,f.的根、叶及花。产于福建、浙江、安徽、湖南、湖北、贵州等地，主要分布在长江中下游地区。雷公藤是我国近年来开发的一种新的药物资源，临床上已被应用于治疗类风湿关节炎、肾小球肾炎，系统性红斑狼疮、麻风病、自身免疫性疾病和皮肤病。近年来研究还发现雷公藤有抗炎、免疫抑制、抗生育、抗肿瘤、抗菌等活性。雷公藤属植物中分离出几十种化学成分，主要为生物碱类、二萜类、三萜类、倍半萜类、糖和木质素类。雷公藤中主要活性成分为生物碱类和二萜类化合物1、雷公藤甲素的微生物转化

从31株微生物中筛进出短刺小克银汉霉CunninghamellablakesleanaAS3.90对雷公藤甲素(1-6)进行生物转化(图116)，得到7个产物，分别是5-羟基雷公藤甲素(1-8)、19α-羟基雷公藤甲素(1-9)、19β-羟基雷公藤甲素(1-10)、雷公藤乙素(β-羟基雷公藤甲素，1-11)、16-羟基雷公藤甲素(1-12)、和雷醇内酯(15-羟基雷公藤甲素，1-13)等其中1-8、1-9、1-10为新化合物。2、雷公藤内酯酮的生物转化

Ning等利用黑曲霉Asperg