SDSPAGE电泳注意事项

SDSPAGE电泳注意事项SDSPAGE电泳注意事项3/3SDSPAGE电泳注意事项SDS是阴离子去污剂，作为变性剂和助溶试剂，它能断裂分子内和分子间的氢键，使分子去折叠，破坏蛋白分子的二、三级结构。强还原剂如巯基乙醇，二硫苏糖醇能使半胱氨酸残基间的二硫键断裂。在样品和凝胶中加入还原剂和SDS后，分子被解聚成多肽链，解聚后的氨基酸侧链和SDS结合成蛋白-SDS胶束，所带的负电荷大大高出了蛋白原有的电荷量，这样就除掉了不同样分子间的电荷差别和结构差别。浓缩胶的作用是有积聚作用，凝胶浓度较小，孔径较大，把较稀的样品加在浓缩胶上，经过大孔径凝胶的迁移作用而被浓缩至一个狭窄的区带。聚丙烯酰胺凝胶由单体丙烯酰胺和甲叉双丙烯酰胺聚合而成，催化聚合的常用方法有两种：化学聚合法和光聚合法。化学聚合以过硫酸铵（AP）为催化剂，以四甲基乙二胺（TEMED）为加速剂。不连续系统由电极缓冲液、浓缩胶及分别胶所组成。浓缩胶是由AP催化聚合而成的大孔胶，凝胶缓冲液为的Tris-HCl。分别胶是由AP催化聚合而成的小孔胶，凝胶缓冲液为Tris-HCl。电极缓冲液是Tris-甘氨酸缓冲液。2种孔径的凝胶、2种缓冲系统、3种pH值使不连续体系形成了凝胶孔径、pH值、缓冲液离子成分的不连续性，这是样品浓缩的主要因素。SDS－聚丙烯酰胺凝胶电泳经常应用于提纯过程中纯度的检测，纯化的蛋白质平时在SDS电泳上应只有一条带，但若是蛋白质是由不同样的亚基组成的，它在电泳中可能会形成分别对应于各个亚基的几条带。注意问题1.样品办理上样缓冲液的作用：形成SDS-蛋白复合物，使其带负电；SDS和巯基乙醇使蛋白质解离，综上两点为了在电泳中，只依照分子量来分别。SDS作用：去蛋白质电荷、解离蛋白质之间的氢键、取消蛋白分子内的疏水作用、去多肽折叠，还有助溶剂的作用。SDS电泳凝胶中各主要成分的作用（1）浓缩与分别胶凝固的利害直接关系到电泳成功与否，与促凝剂及环境亲近相关。提高SDS电泳分辨率的路子待凝胶在室温凝固后，可在室温下放置一段时间使用。忌即配即用或4度冰箱放置，前者易以致凝固不充分，后者可以致SDS结晶。一般凝胶可在室温下保存4天，SDS可水解聚丙烯酰胺。4..“微笑”（两边翘起中间凹下）形带原因主若是由于凝胶的中间部分凝固不均匀所致，多出现于较厚的凝胶中。办理方法：待其充分凝固再作后续实验。“皱眉”（两边向下中间鼓起）形带原因主要出现在蛋白质垂直电泳槽中，一般是两板之间的底部缝隙气泡未消除干净。办理方法：可在两板间加入合适缓冲液，以消除气泡。带出现拖尾现象主若是样品融解收效不好或分别胶浓度过大引起的。办理方法：加样前离心；选择合适的样品缓冲液，加合适样品促溶剂；电泳缓冲液时间过长，重新配制；降低凝胶浓度。带出现纹理现象主若是样品不溶性颗粒引起的。办理方法：加样前离心；加合适样品促溶剂。溴酚蓝不能够起到指示作用实验中常会遇到溴酚蓝已跑出板底，但蛋白质却还未跑下来的现象。主要与缓冲液和分别胶的浓度相关。办理方法：更换正确pH值的Buffer；降低分别胶的浓度。电泳的条带很粗电泳中条带很粗是常有的事，主若是未浓缩好的原因。办理方法：合适增加浓缩胶的长度；保证浓缩胶贮液的pH正确（）；合适降低电压；电泳电压很高而电流却很低呢比方电压50v以上，可电流却在5mA以下。主若是由于电泳槽没有正确装置，电流未形成通路。包括：a.内外槽装反；b.外槽液过少；c.电泳槽底部的绝缘体未去掉（比方倒胶用的橡胶皮）。浓缩胶与分别胶断裂、板间有气泡对电泳影响一般对电泳不会有太大的影响。前者主要原因是拔梳子用力不均匀或过猛所致；后者是由于在清除制胶的夹子后，板未压紧而致空气进入引起的。12.凝胶时间不对，或慢或快平时胶在

30MIN-1H

内凝。若是凝的太慢，可能是

TEMED，APS剂量不够也许无效。

APS应该现配现用，

TEMED不牢固，易被氧化成黄色。

若是凝的太快，可能是

APS和

TEMED用量过多，此时胶太硬易裂，电泳时易烧胶。13.电泳时间比正常要长可能由于凝胶缓冲系统和电级缓冲系统地PH选择错误，即缓冲系统地PH和被分别物质的等电点差别太小，或缓冲系统的离子强度太高。分别胶加上后为什么要马上加水加入分别胶后，马上覆一层双蒸水，一是为了使分别胶界面保持水平，用水就可以把它压平，使蛋白质分子跑时在同一水平线上；二是阻拦空气中的氧气对凝胶聚合的控制作用。注意：SDS电泳要点在于胶可否制得均匀平展，自然这跟灌胶用的模具和方法有必然关系。加入TEMED和过硫酸铵后丙烯酰胺开始聚合，但是过硫酸铵易被氧化，所以操作要迅速，而且最后要液封，保证模具内不漏气才能使胶聚合的很好。同时不要把制胶用的玻璃板中间压太紧，这样