原位杂交2课件

原位杂交技术病理科贺骏基因过表达的检测:表达产物的检测:immunohistochemistryELISA基因扩增的检测:insituhybridizationFISH原位PCR

基本原理原位核酸分子杂交技术简称原位杂交(insituhybridization),是应用已知碱基顺序并带有标记物的核酸探针与组织、细胞中待测的核酸按碱基配对的原理进行特异性结合而形成杂交体，然后再应用与标记物相应的检测系统，通过免疫组织化学方法在被检测的核酸原位形成一定颜色的杂交信号。分子杂交的特异性强、灵敏度高，同时又有组织细胞化学染色的可见性。既可用新鲜组织，又可用石蜡包埋组织作回顾性研究。所需样本量少，可用与活组织细针穿刺组织。应用范围广泛，可对特定的基因DNA、mRNA的表达进行定位、定性、定量。原位杂交技术的优点:探针（probe）是含有互补顺序的外源性被标记的DNA或RNA片段，是在原位杂交中用于检测细胞内特定DNA或RNA顺序定位的特殊试剂，探针的碱基序列是已知的，只能与特定的核酸分子结合。探针:DNA探针RNA探针寡核苷酸探针常用的探针种类:放射性标记：标记物为放射性同位素，敏感性高、特异性好，但对人体有伤害性。非放射性标记：生物素、地高辛、荧光素、酶类。探针标记的种类:根据探针标记物是否能直接被检测到，分为：1直接法：标记物为放射性同位素、酶或荧光2间接法：标记物为半抗原，如地高辛（DIG）或生物素(biotion)原位杂交的类型:1固定：保持细胞形态结构,最大限度地保存细胞内的DNA或RNA的水平.最常用多聚甲醛固定组织(不会与蛋白质产生广泛的交叉连接,不会影响探针穿透细胞或组织)2玻片的处理：多聚赖氨酸液、APES杂交前准备

注意:在增强组织的通透性的同时也会降低RNA的保存量和影响组织结构的形态.因此用量及孵育时间上应谨慎掌握

杂交前准备4防止RNA酶的污染

原因:手指皮肤及实验用玻璃皿上均可能有RNA酶措施:在整个杂交前处理过程都需戴消毒手套,所有实验用玻璃器皿及镊子都应与实验前一天置于高温(180℃)烘烤,以达到消除RNA酶的目的.杂交前准备杂交是将杂交液滴加于要检测的组织或细胞片上，加盖硅化的盖玻片，为了防止杂交液的蒸发，可在盖玻片周围用rubbercement封固，时间为12－20h。温度为37℃-52℃.杂交注意:如果探针为双链DNA探针,则杂交前应有变性这一过程.方法:分开变性共同变性(应用原位PCR仪或原位杂交仪)杂交目的：去除过剩的探针，减少非特异性信号。方法：采用高盐浓度漂洗,减少探针与组织静电结合。注意:漂洗的过程中切勿使切片干燥.杂交后处理(posthybridizationtreatment)人类表皮生长因子受体-2(HER2)是一种受体型的酪氨酸激酶,它在20%-30%的原发性乳腺癌中有基因的异常扩增和蛋白的过度表达.赫赛汀是一种重组DNA衍生的人源化单克隆抗体,适合于治疗HER-2过度表达的乳腺癌.显色原位杂交（CISH）

检测HER-2基因的扩增水平显色原位杂交（CISH）

检测HER-2基因的扩增水平目前有几种HER-2检测方法，最常用的是免疫组织化学法（IHC）检测HER-2受体蛋白的过度表达，根据IHC的结果选择性地运用显色原位杂交（CISH）和荧光原位杂交法（FISH）检测HER-2基因扩增的水平。显色原位杂交（CISH)在福尔马林固定石蜡包埋的组织中使用地高辛标记的探针进行杂交反应，再用鼠抗地高辛－抗体和辣根过氧化物酶－抗鼠抗体进行免疫结合，最后DAB显色，CISH监测HER-2基因信号在普通亮视野显微镜下观察。近年来国内外许多文献报道乳腺癌中CISH与FISH的符合率为93.8％～100％。显色原位杂交

(CISH,ChromogenicinSituhybridization)CISH操作流程：Ⅰ预处理Ⅱ变性和杂交Ⅲ严格洗涤Ⅳ免疫显色Ⅴ衬染和封片Ⅵ镜下观察和结果判读Ⅰ预处理

1.标本的固定:从取材到固定的时间不超过1小时.固定时间以6小时到24小时为宜.固定液选择10%中性(磷酸缓冲)福尔马林固定液.2.组织切片:4-5μm,蜡块切片后不宜置于室温时间过长,不超过4周.Ⅰ预处理3.脱蜡至水4.加热预处理（热处理缓冲液加热达到98～100℃时放入组织切片，保持15分钟）Ⅰ预处理

5.胃蛋白酶消化（胃蛋白酶消化液滴加到组织上，室温（RT）保持5～30分钟）注意:孵育具体时间长短依赖于组织的固定方式和固定时间.过度消化会破坏核和染色体结构,消化不足会导致信号丢失.6.梯度脱水Ⅱ变性和杂交分开变性(无原位PCR仪和原位杂交仪):1.在新鲜配制的变性缓冲液将组织变性75℃,5分钟2.梯度脱水3.空气中自然干燥4.将探针变性75℃,5分钟5.将变性后的探针立即于冰水中淬冷6.滴加探针:杂交膜上滴加足够的探针(约13-15μl),将杂交膜盖在组织上7.暗湿盒37℃过夜(超过12小时)Ⅲ严格洗涤杂交后，小心去除封片胶和杂交膜严格洗涤：SSC，室温下片刻SSC，75℃，5分钟

（超过1张切片，每多加1张切片，温度应提高1℃，但是最高不要超过80℃）Ⅳ免疫显色室温下滴加3％H2O2甲醇溶液10分钟PBS/Tween20（0.025％）冲洗2分钟×3次室温下滴加封闭液封闭10分钟去除多余封闭液（无需冲洗）Ⅳ免疫显色滴加鼠抗DIG抗体，室温下孵育30分钟PBS/Tween20（0.025％）冲洗2分钟×3次滴加HRP－抗鼠抗体，室温下孵育30分钟PBS/Tween20（0.025％）冲洗2分钟×3次Ⅳ免疫显色DAB显色滴加显色液，显色30分钟自来水冲洗2分钟Ⅴ衬染和封片苏木素衬染5秒到1分钟（具体时间因组织不同而异，衬染过深会遮盖阳性信号，不利于观察。）自来水冲洗2分钟梯度脱水Ⅵ镜下观察和结果判读标准亮视野显微镜400×光镜下观察无扩增大于50％的肿瘤细胞核内有1～5个信号点低拷贝扩增大于50％的肿瘤细胞核内有6～10个信号点高拷贝扩增大于50％的肿瘤细胞核内有大于10个信号点或者凝结成团块状、簇状粗颗粒信号操作过程中以下因素可能影响CISH的结果：加热预处理的温度和时间胃酶消化的时间长短加热共同变性时杂交液的蒸发杂交后洗涤是否干净苏木素衬染深浅针对以上的因素，在进行CISH检测时，我们应该注意以下几点：加热预处理的温度保证在98℃以上，最好完全煮沸，时间为15分钟；胃酶的具体消化时间因组织的固定时间、固定方式、切片的厚度而异，建议时间为10分钟左右。杂交液滴加后，变性前，组织必须覆盖杂交膜，再用封片胶密封，防止杂交液的蒸发。杂交后洗涤温度