卫生统计学-综合实验课中文

卫生毒理学综合性实验则(Dr&毒理教研室 DepartmentofToxicology,SchoolofPublicTianjinMedical为什么要开设综合实验课毒理学：研究外源化学物与机体有害的交互作用，毒理是一门实验科学实验工体内实 体外实综合实验课开课了解毒理学学营 劳动环境卫内在和表内在和表流行病统了解毒理学学科 领域的地疾 靶

临床

临床I,II, FDA批准上发现阶(筛选、优化、确定候选药物临床前开发阶 临床开发阶

临床阶(2-5years)

FileFile

(1-3

Scale-

FileclinicalFile

(2-31$10

$50 $400-新药研发：高投入，高失败率，周期长，风险

了解毒理学实动物实验操作（孟革，1，2班，105）、酯酶和UGT酶活性表征（刘永哲 3，4班动物实验操作（孟革，3，4班，105）、酯酶和UGT酶活性表征（刘永哲 1，2班，108动物实验考核（孟革，1，2班，105）、酯酶和UGT酶活性表征考核（刘永哲 3，4班，108动物实验考核（孟革，3，4班，105）、酯酶和UGT酶活性表征考核（刘永哲 1，2班，108成绩组基础课小测试（20%）+平时实验记录+最后实验考试动物实代谢酶动力学基本理I相代谢-酯II相代谢-

一、实验动物的基本原则代谢、生化、毒理学特征与人接近自 不太易于饲养和实验操作经济且易于获得标注：遗传背景清楚，可以进行相应 操作，创造出新型 改造动实验动物微生物等级分饲养环 要开放系 无饲养环 要开放系 无传染给人的传染屏障系 除I级标准外，种系清楚，无动物特有的传屏障或除II级标准外，按纯系要求系 殖，饲养 器内或层流 无菌动 系 在全封闭无菌条件下饲养的微生物和（包括绝大部分）实验动物 选：对于首次试验的受试物，要用两 实验动物。若已知不的动物对受试物敏感性不一，要选择敏感的和体重：毒理学试验选用实验动物的取决于试验类型。如急性试验通常用成年动物；慢性试验因实验周期较长，要选用较年幼或刚断乳的动物。实验动物应按其出生日期来计算，但实际工作中一般以动物体重粗略地判断其，体重是选择适龄动物的依据。同一试验中，组内间体重差异要小于10%，组间平均体重差异不应超过5%。生理状态：应选用未产未孕的雌性动物。雌雄动物应分笼饲养。但是，在显性致死试验、致畸试验、繁殖试验等，需要有计划地合笼交健康状况：健康动物健康的实验动发育正常、体形健壮，无外观畸形，被毛浓密、有光泽、不蓬乱、行动灵活、反应敏捷、眼睛明亮有神、为保证选择的动物健康，通常在实验前观察5-7抓 鉴标记分 染毒途 解代谢酶动力学基本理EnzymeKineticsofMetabolizing化合物作用位吸游离化合代排在组织中累结合血浆蛋外源抑制抑制底诱导代谢无效代谢 有效代谢 毒性代谢活 活性增

活性改 毒 肝匀浆

沉淀900020900020

上清液(细胞液上清

10500060min10500060min105000沉淀(微粒体

沉淀上清早早期ADME/T研酶：几乎所有的酶都是蛋白质，在酶的蛋白分子上不是所有的氨基酸都起到催化作用，而是数氨基酸和酶的催化作用直接相关。这些氨基酸一般集中在酶的特定区域，我们称之为酶的催化中心或者活性中心。1913年，Michaelis和Menten根据中间产物学说推导出来的一个数学方程式SESEEEP结催结催反底物、单酶（即单位点稳态的动力学底物浓度大大超过游离酶的[ES]恒SS[P可忽略不PEE+

K2K稳

E+形成

= 符合米氏常

产物生产速

最大产物生产速KmE+

K2K

E+vvVmaxo +mS1S1S2m2

)/K=K/K

121ma121maKm[ES]应应用结合的亲和预测抑制潜代谢酶识vovoVmax +m应用评间的差[SKm固有清除率(Clint[S]=低→ [S]=10倍Km浓

v1Km1 Vmax[S] V

vo

VmaxKm+0优点：结果比较直观，易判缺点底物浓度选择般接近对V0取倒数放底物浓

0

2斜率- - ovovVmax

V

率=- [S]

v

m +m +优点：可以表征酶动力学与米氏方程的偏离程缺点：线性相关系数较

V五味子 肝微粒体酶甲基化的动力学参Caoetal.(2009)双酶模

v Vmax1[S Kmax1[S

Vmax2[S]Kmax2[S]

Eadie-Hofstee作图多结合位点模型可解 型动力Hill方程 [Sv S50n[SS50)Houstonetal.(2005)ArchBiochemBiophys433(2):351-

可逆抑制剂:与酶以非共价键结合而引起酶活性不可逆抑制剂:与酶的必需基团以共价键结合引起酶活性的降低或丧失， 不能逆转

KsES

KSKi=kp=Shouetal.(2000)CurrDrugMetab2(1):17-竞争性抑制:只与游离酶结合

KsES

[I V [S]V Dixon作图

mm

K

Km(1[I]/

M非竞争性抑不仅可以与游离酶结合，也可以与ES复合体

KsES

EI和ESI都无酶活性斜-斜---

混合抑制:通过潜在对酶亲和力的不同，既可以结合游离酶，

-

α<1，Km反竞争性抑制仅与ES

v Vmax[SKS [S](1[I])KSi1111Ki V [S]V(-反竞争性抑制的结合-物激活位点-

)Zhangetal.(2006)EurJClinPharmacol62:竞争非竞争反竞争

EEII竞争性抑制竞争性抑制机制失E+EIEE-+代Polasek&Miners(2007)ExpertOpinDrugMetabToxicol3(3):321- vvVmaxo +m应用结合亲和预测潜在抑制代谢酶识评间差米氏动力学SKm固有清除率 代谢酶动力学研 竞争

I非竞争

I反竞争E I I

E+S→ES→E++I

E+S→ES→E+

E+S→ES→E++I ↓ [I]仅与游离[E]结合可解除[I]的抑制

EI+S[I与游离[E]或[ES复合物结合;增加[S[I

[I]仅与[ES复合物结合, 竞争

I非竞争

I反竞争

Km [S],

Km=

[S],

[S],Vmax

Vmax

和

相交于Y

相交X

平行

Noscapine---explainingclinicalDDIbetweennoscapineandONO OO

Antitumor(Phase 12clinicalcasesoftheinteractionbetweennoscapineandAn82-year-oldmale(warfarin+noscapine(50mg11increasedINR+1CancerChemothPharm2007;60:831-BrJofClinPharmacol2008;65:277-OHOHOO

Inhibitionof

?BrJofClinPharmacol2008;65:277-PharmacolTherapeut1997;73:67-Basiccomponents:NADPH,humanlivermicrosomes,probeandphosphate100uM positive100 80 60 40 20 10 5CYPIC50%ControlActivity I相代谢研究—酯PhaseImetabolism—分类和命名催化机制底物特异性分布种属差异&实例(酯酶Drugmetabolism清除清除氧化氧化水解结合移以不200药物的消除途径BjornssonTD,etal.JClinPharmacol2003;43(5):443-69WienkersLC,HeathTG.NatRevDrugDiscov.2005Oct;4(10):825-酯酯依那普 奥塞米

伊立替NatureReviewsDrugDiscovery.2008;7:255-AB+H2O→AOH+全缩酶的国际系统分 (ECnumber)是按照酶促反应类型进行数字分类丝氨酸丝氨酸水解C酯酯AAB无作用无作用抑水乙酰胆碱乙酰胆碱脂丁酰胆碱脂羧酸酯AldridgeWN.Chem.Biol.Interact.1993;人和动物的AChE识别百分比IdentityRMouseCHumanHuman人和动物的BChE识别百分比IdentityRatMouseEquineCatHumanHuman人CES亚型识别百分比HumanHumanHumanHumanHumanHumanHumanHumanHumanHumanComparativeBiochemistryandPhysiology,PartD4(2009)羧酸酯酶分羧酸酯酶 的系统进化树,用 配对法分析(UPGMA)的聚类图将CES同工为五个CESCESCESCESCESSatohT.HosokawaChem-BioIntera.162(2006)哺乳动物CEs的晶体结hCE1绑定Soman

Biochemistry.2007May1;46(17): CES的结构特DrugDiscoveryToday

Z-位点：三聚体-

酯酶B的机动力学机OOO

Jbiochemmoltoxic.催化机

Ces的机二步催化机

DrugDiscoveryToday底物的酯交换 酯酶的动力型动力1,米氏方程2,底物抑制模型

硫代丁酰胆碱被HuBuChE水解的pS-曲3,双位点模Eq.Eq.

Eq.Chem-BiolInteract.1999;CES的底物特异（（甲酯哌哌替替替莫普伊伊立替CES3甲甲基强的松龙琥珀Molecules2008,13,412-酯酶代谢(基本信息酶肝（或其他组织）的准备,S9,微粒体纯化酶重组系统体缓冲底或者缓冲抑制剂底酶分纯化的羧酸酯酶BuChE&重组亚型特异性抑制剂免疫组化方法酯酶的抑制Compound arylesterase-andA-esterasespecificinhibitor potentinhibitorofserineesterase potentinhibitorofserineesterasetri-o- serineesterase

aninhibitorofserine

inhibitorofcarboxylesteraseand

anaromaticesteraseiso- aselectiveinhibitorofhuperzine-

apowerfulselectiveinhibitorof apowerfulselectiveinhibitorofacetylcholinesterase& astronginhibitorofCES1,Ki=8.0nM;alsostronginhibitorofhiCE,Ki=5.6nM;bis-nitrophenyl aselectiveinhibitorofcarboxylesterase,alsoof astronginhibitorofCES2,Ki=1.5muM;itonlyinhibitsCES1A1(IC50=0.44纯化&抗纯化酶2人丁酰胆碱酯酶抗体羧酸酯酶1-6CES1-6)抗体抗-(1,2)抗体分胆碱酯酶类的分在哺乳动物中枢神经系统（主要在脑部血浆肝肠(上皮细胞肌肉心脏肺肾胰腺皮AChEBChE在种属和组织呈现分羧酸酯酶类的分在哺乳动物肝内质网(表达丰富；肠肺皮肤血液心脏肌中的主要酯人羧酸酯酶1A(hCE-1),人羧酸酯2A(hCE-人乙酰胆碱酯酶(AChE),人丁酰胆碱酯酶 对氧磷酶类类 定 羧酸酯 血液，肝，脑，肾，肺，肌肉，肠，胃，皮肤心脏 ，宫颈 ，胰腺J.Pharm.Sci.2006,95:1177- 中的分分布肝，小肠，肾，肺，脑结肠，巨噬细胞，单核细胞人血浆中CesBuChE不同的亚型分布在肝和肠

人类组织和caco-2细胞的聚丙烯酰氨凝胶电（A）和RT-PCR分析脑部CEs,血脑屏障系统的组成成分ImaiT,TaketaniMetal.DMD,2006;羧酸酯酶同工酶在毒物代谢中的作CES:羧酸酯酶CYP:细胞色素CES:羧酸酯酶CYP:细胞色素UGTUDP葡萄醛酸转移酶MDR多药抗药性种属差异&实CBF的水解作用—种属差DeacetylDeacetyl华蟾酥毒素的结

UFLC轮CBF的水解作用—相关的在大鼠肝中，BuChE是主要代谢酶的表征120100806040200

10uM100uM 基)磷酸盐，CEs和胆碱酯酶的选择性抑制剂；iso-MPA=四异丙基焦磷酸亚胺，BuChE的选择性抑制剂；BB=1,4-二苄基，CES1和hiCE的强抑制剂；EDTA=乙二胺四乙酸，一种芳香族酯酶抑制剂；HA，石杉碱甲,AChE的选择性抑制剂。Boc5的水解作用—种属差不同种属的肝微粒体Boc5 代谢轮Boc5的水解作用—代谢通用LC/MS鉴定代谢物,Boc5的水解作用—相关的在小鼠肝脏中，BuChE是主要代谢酶的表征TOTP,一种有效的丝氨酸酯酶抑制剂;BNPPCEs和胆碱酯酶的选择性抑制剂;iso-MPA,BuChE的选择性抑制剂;代谢稳定性研究(酯酶工作需相关代谢酯酶的确认代谢通路的阐述酯酶的分配(或亚型动力学研究除虫菊素类的水解代相关代谢酯酶的代谢的轮廓

5mM反式-氯菊50mM反式-氯菊BiochemPharmacol2006;71:657-酯酶的分选选择性抑制hCE-hCE-1抗kkcat(min-kcat/Km(min-1mM-hCE-hCE- BiochemPharmacol2006;71:657-动力学研A,用小鼠、大鼠、人肝微粒体得到的反式-和顺式-氯菊酯的水解动B,通过Eadie–Hofstee作图法将在（A）中人肝ProteinswithEsterase-likeOxidativePathwaysofEsterCleavage—Humanserumalbumin(HSA) 白蛋白Peptidase肽酶Aldehydedehydrogenase醛脱氢酶Carbonicanhydrases碳酸酐酶Lipase脂肪酶Trypsin胰蛋白1,选择性酯酶抑制

&展选择性羧酸酯酶抑制剂可有效联合药物，减少剂量，副作用和药物相互的作2选择底物&探3酯酶-UGT&酯酶-转运蛋白相基于酯酶的前体药物设人类肺癌细胞表达的酶可以将CPT-11转化为SN-治疗治疗前体药活性代谢IIII分类和命名催化机制底物特异性分布种属差异&实例 药物代谢清除机 可能参与代谢的酶/蛋氧化代 结合代 Wienersetal.(2005)NatureRevDrugDiscov4:825-研究意磺基转移Sulfotransferases,公认名

SULTs酶命Sulfotransferase磺基转移反应

3’-磷酸腺苷酰硫3'-phosphoadenylylsulfate+acceptor=adenosinebisphosphate+acceptor通用 全ECECEC

转移酶的国际系统分 (ECnumber)是按照酶促反应类型进行数字分类 SULT催化机 在这个反应中有三步同底物结合形成SULT酶分类 相似图. SULT酶三hSULT1A1PAPpNP的图形结构。PAPpNP1pNP1，黄色。SULT亚型酶分布及底物特SULT体外代谢研究体系选可用体 可发现的代谢特酶稳定

代不稳定

酶抑 酶代多态

活性代物生原代肝细√√肝切√√√肝细胞悬√√√肝S9部重组单√√√√√√√√肝肝肝肝S9孵育体磷酸盐缓冲溶底终浓pH（0.25~10mM终浓度(50-500uM终浓度 (如SO3-,SO4-)。SULT的活性，在猪中低，而在猫中高产物一般分泌入儿茶酚胺氧位甲基转移 hol-O-Methyltransferase,儿茶酚胺氧位甲基转移酶简COMT是多巴胺、肾上腺素、去甲肾上腺素等儿茶酚胺类的主要代谢酶。它催化儿茶酚胺第3位羟基甲基化,降解儿茶酚胺Monoamineoxidase多巴胺Aldehyde多巴胺O OOOO

Catechol-O-methyltransferaseO5-5-（5-Aldehydedehydrogenase高香草酸 COMT催化机作用机制为COMT将甲基供体上的甲基转移至儿茶酚胺的3位和4 公认名

COMTs酶命Catechol-O-methyltransferase儿茶酚-O-甲基转移酶反应S-adenosyl-L-methionine+acatechol=S-adenosyl-homocysteine+a通用 全ECECECEC

转移儿茶酚-O-甲基转移酶的国际系统分 (ECnumber)是按照酶促反应类型进行数字分类COMT三维结COMT与SAM和3,5-二硝基儿茶酚结合 COMTs酶分类—催化反应类COMTs酶分类及分大多数COMT以可溶形式 存在于大多 组织中，除了脑大约所有COMT70% T)COMTs酶底无机和砷都能被单-和双-无机硒能 化COMTs酶抑制连苯三酚和儿茶酚的衍生物，通常是COMTCOMTs酶抑制 图为硝基儿茶酚型第二代图为硝基儿茶酚型第二代COMTCOMTs酶抑制

体外IC509 COMTs体外代谢研究体系选可用体 可发现的代谢特酶稳定

代不稳定

酶抑 酶代多态

活性代物生原代肝细√√肝切√√√肝细胞悬√√√肝S9部重组单√√√√√√√√肝肝肝肝S9孵育体磷酸盐缓冲溶底终浓（0.25~10mM终浓度(50-200uM终浓度重组酶孵育体重重TT使底物微溶于水重要底物：肾上腺素，去甲肾上腺素，多巴胺，左旋多巴，儿酚雌激素蛋白质，脂类，磷脂和核酸COMT在 UGT酶介导反应形 底底

底 底

UGTs是II相催化反应的主要酶，如外源性和内源性基（-OH，-COOH，-NH2，C-C，或–SH）的葡萄糖醛酸转移。外源性物质可能是药物分子，内源性物质可能是胆红素，胆汁酸，甲状腺素，生物胺，或类固醇。UGT作为一种膜锚定蛋白,UGT酶的分离纯化研究相 内质网pH （Kimetat.,1998[Mg+]1mM(Bergetal.,1995

活性位细胞细胞

图为内质网中的膜UGT UGT酶一级结 structureof在 中UGT 成员共享羧基端的246个氨基酸残基，其氨基端共有285个氨基酸残基；不同的同工酶是由不同的氨基端构成的，羧基端成为保守区，是不同的同酶与UDPGA结合的共同区域而氨基端则是与底物结合的部位，该部位决定特定UGT同工酶的底物特性UDP-葡萄糖醛酸转移酶是一个 ，

序列分

括两个

(UGT1和UGT2和三个亚族

BA

UGT酶底物多样 UGT酶表现出广泛并通常是交叉的底物特异性。UGT酶的底物多种多样，包括许多外源性有害物质（药物、毒物、治癌剂等）以及许多内源性物质（胆红素、胆汁酸、激素等）UGT介导的葡萄糖醛酸化反应过程不但会影响这些化合物在机体内的浓度，还能导致多种生理学、药理学底 相关UGT亚Arachidonicacid（花生四烯酸）Glycyrrhetinicacid（次酸）…

UGT1A1,UGT1A3,UGT1A6,UGT1A9,UGT2B7UGT1A1,UGT1A4,UGT1A6,UGT1A9UGT1A1,UGT1A3,UGT1A9,UGT2B7UGT1A1,UGT1A3,UGT1A6,UGT1A9,UGT2B7UGT1A1,UGT1A3,UGT1A6,UGT1A9,UGT2B7UGT1A1,UGT1A3,UGT1A4,UGT1A7,UGT2B7UGT1A6,UGT1A7,UGT1A8,UGT1A9,UGT1A10UGT1A1,UGT1A3,UGT1A4,UGT1A9,UGT1A10UGT1A1,UGT1A3,UGT2B4,UGT2B7UGT亚 探针底

S-oxazepam（S-奥 特异性探针可以用来标定一系列肝微粒体中的活性并在人肝中介导某化合物代谢的亚型酶合物对该酶的抑制或者诱导作用特异性探针还可以评价该酶是否具 多态性 差异UGTUGTUGT亚 选择性抑制

Bilirubin（胆红素Phenybultazone也抑制UGT